circCYP24A1在非小细胞肺癌中促肿瘤生长的分子机制

Circular RNAs (circRNAs) counteract mRNA’s inhibition on its target genes through miRNA sponging. The applicant has discovered in previous studies that the Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) cell line A549 contains a highly abundant CYP24A1-derived circRNA, namely CYP24A1， which is highly resistant to degradation in apoptosis; the back-splicing junction of circCYP24A1 contains the same sequence (10 nt) as in the 3’-UTR region of the CYP24A1 mRNA, this sequence is capable of binding miR-125-5p; circCYP24A1 also exhibited tumor-promoting characteristics; circCYP24A1’s abundance in NSCLC cell lines was much higher than other tumor cell lines. We speculate that circCYP24A1 is part of self-defense mechanism employed by the oncogene CYP24A1 which utilizes the junction sequence of circCYP24A1 to buffer miR-125-5’s suppression; secondly, circCYP24A1 is distinctively highly expressed in NSCLC. Based on current results, this project intends to implement the following studies 1) molecular mechanism of circCYP24A1 responsible for its tumor-promoting potential in NSCLC; 2) the potentiality of circCYP24A1 being as a NSCLC biomarker.

环状RNA(circRNA)主要通过结合小RNA(miRNA)减免miRNA对靶基因的抑制。申请人在前期研究中发现，来源于原癌基因CYP24A1的circCYP24A1高度富集于非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549中，且高度抵抗凋亡中的核酸降解过程；circCYP24A1的接口序列(10nt)与CYP24A1 mRNA 3'UTR中结合miR-125-5p的序列相同；circCYP24A1表现出促肿瘤生长特征；circCYP24A1在NSCLC细胞系中的表达量远高于其他肿瘤细胞系。我们提出假说：circCYP24A1通过其接口序列，结合并减免抑癌因子miR-125-5p对CYP24A1的抑制，从而促进肿瘤生长。根据现有研究基础，本项目拟展开对circCYP24A1在NSCLC中促肿瘤生长的分子机制研究，以及circCYP24A1作为NSCLC生物标志物的价值研究。

环状RNA（circRNA）是近几年才发现的首尾相连成环状的RNA分子。本研究通过转录组测序，在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系A549及其凋亡小体中，发现一种丰度远高于其他环状RNA的circRNA，即circCYP24A1。..我们通过两种不同序列的shRNA对circCYP24A1进行稳定敲除。结果表明，两种稳敲细胞均表现出增殖和迁移速度降低的现象，且两种稳敲细胞自然凋亡以及通过凋亡诱导剂处理后的细胞凋亡比例，较空白组有明显提高。回补实验表明，在两种稳敲细胞中超表达circCYP24A1，各类表型有所回复。两种稳敲细胞在裸鼠中成瘤的体积较对照组均有所变小。..我们通过生信学工具预测，circCYP24A1可能是抑癌miRNA miR-125-5p（后简称125-5p）以及其他几种miRNA的分子海绵。双荧光光素酶以及RNA pulldown实验表明，与circCYP24A1亲和力最高的是miRNA是125-5p。下游的western blot实验结果表明，circCYP24A1可以降低125-5p对其预测靶点CYP24A1的抑制作用，却无法降低125-5p对RAF1和HK2的抑制作用。RNA荧光原位杂交实验表明，circCYP24A1与CYP24A1 mRNA 共定位。..circ-/shRNA1A549（其中一种稳敲细胞）在依托泊苷诱导下产生的凋亡小体，与对照组A549相比，其circCYP24A1的含量明显降低。我们将circ-/shRNA1A549和scrambleA549的凋亡小体共培养后，稳敲细胞的表型均有所恢复。qPCR检测表明，共培养后，稳敲的两种细胞系circCYP24A1的表达明显提高。Western blot结果表明，共培养后，稳敲的两种细胞系CYP24A1的表达明显提高。..通过对39对NSCLC临床组织样本中circCYP24A1的检测发现，肿瘤组织中circCYP24A1的含量明显高于癌旁组织。因此，circCYP24A1又成为潜在的NSCLC标志物。..本项目研究表明，circCYP24A1在NSCLC中是促肿瘤的circRNA，其功能是保护CYP24A1的mRNA不被125-5p或相似序列的miRNA所抑制。circCYP24A1在NSCLC的肿瘤组织和血浆外泌体中高表达，可作为NSCLC的标志物。

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