KIAA1377在食管癌淋巴结转移中的作用及机制研究

It was clinically observed that the majority of patients with Esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) whose tumors have often been metastasized with lymph nodes.however, the molecular mechasnism underlying lymph node metastasis has been largely unkown. It has been reported that somatic cell fusion can promote the invasion and metastasis of hybridoma.In our previous works, it has been found using CGH approach that KIAA 1377 was pronounced amplified in esophageal cancer cell metastasized with lymphnodes, implying that KIAA 1377 may play a key role in the lymph node metastasis of ESCC.the molecular mechanism underlying, however, has been unknown. In the present study, it is proposed to explore the role in the fusion of esophageal cancer cells with phygocytes using RNAi and overexpression on cell line level and to observe the ensuing invasion and migration variablity of hybrid ESCC cell line; it is proposed to analyze the subcellular localization and which domain of the peptide works using immunofluorescence and PCR-based site-directed mutagenesis; and to analyze the clinicpathological significance of amplification and expression of KIAA1377, using Fluorescent in situ hybridization (FISH) and Immunohistochemistry (IHC) on tissue level; xenografted nude mice were harnessed to analyze its migration ability in vivo under the help of microPET. Together, all the proposals presented here will elucidate the molecular mechanism of KIAA 1377 in the lymph node metastasis of ESCC,providing the new perspective and theoretical evidence for lymph node metastasis.

临床发现食管癌患者多半发生食管癌淋巴结转移，导致患者术后生存率较差，但食管癌淋巴结转移机制不清楚。研究表明，体细胞融合能够促进肿瘤的侵袭转移。前期研究中，我们通过比较基因组杂交技术从术后淋巴结转移和非转移的食管鳞癌细胞中，发现KIAA1377分子在淋巴结转移灶癌细胞中显著性地扩增，提示该分子在食管癌淋巴结转移过程中具有一定的作用，但其具体的分子机制未知。本研究拟围绕"KIAA1377过表达促进了食管癌细胞和巨噬细胞的融合，进而促进食管癌的淋巴结转移"这一科学假说，拟从体外细胞系，体内裸鼠实验和临床组织标本3个水平上，运用多种分子生物与生物化学实验技术手段探讨KIAA1377分子在食管癌细胞和组织细胞融合中的作用，阐明KIAA1377在食管癌淋巴结转移中作用的分子机制，为食管癌淋巴结转移的临床管理和治疗提供新的思路和理论依据。

KIAA1377基因在细胞生物学和神经性疾病中有零星的报道，但在肿瘤研究中未见报道。在前期研究过程中，我们通过比较基因组研究技术发现KIAA1377基因在哈萨克族食管癌组织中呈显著性扩增，提示KIAA1377在食管癌发生发展中起着一定得作用。但是，其作用未知。为了探讨KIAA1377的蛋白表达及其表达的临床病理学意义，我们运用免疫组化技术分析了KIAA1377在食管鳞癌组织芯片(含有86个食管鳞癌组织点和78个配对的癌旁正常组织点)中的表达，并且结合其临床病理学意义分析其表达的临床病理学意义。为了进一步验证，我们在体外培养了食管鳞癌细胞系TE-1和EC9706细胞系，运用短发夹RNA (shRNA)干扰技术沉默KIAA1377, 分别运用Transwell和细胞划痕实验评价沉默KIAA1377后对食管癌细胞系浸润和迁移的影响。发现：相比癌旁正常组织，KIAA1377在食管癌组织中显著性高表达；其高表达与食管癌淋巴结转移和分化程度相关，与其它临床病理学参数均不相关；在体外细胞系水平，沉默TE-1和EC9706细胞系中KIAA1377后，细胞增殖和浸润能力没有显著性变化，但是细胞的迁移能力受到了显著性抑制；提示，KIAA1377的表达可能与食管癌淋巴结的微转移相关。前期研究发现KIAA1377分子是食管鳞癌的一个淋巴结转移相关基因，且在食管癌组织中高表达。但是其调控机制不明确。为了明确其调控机制，我们通过生物信息学预测发现let-7b-5p是KIAA1377基因的一个潜在调控微小RNA。但是目前尚未见有相关研究报道，为了验证let-7b-5p与KIAA1377基因之间的调控作用，我们构建了KIAA1377基因3-UTR（3端非翻译区）含有与let-7b-5p结合互补靶点序列的荧光报告素载体极其对照载体；与let-7b-5p模拟序列分别共转染鳞癌细胞系Hela和KYSE-150，运用qRT-PCR技术分别检测荧光强度；此外，我们在鳞癌细胞系Hela和KYSE-150中转染let-7b-5p模拟序列及对照序列后，在mRNA水平上运用qRT-PCR技术分别检测KIAA1377的表达水平变化。我们发现，let-7b-5p是KIAA1377的一个直接调控miRNA，但是调控作用较弱。

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