应用CRISPR/Cas9技术筛选γ珠蛋白基因转录抑制因子BCL11A的结合位点及功能验证

结题报告
项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    81660023
  • 项目类别：
    地区科学基金项目
  • 资助金额：
    37.0万
  • 负责人：
    黄盛文
  • 依托单位：
    贵州省人民医院
  • 学科分类：
    H0802.红细胞与相关疾病
  • 结题年份：
    2020
  • 批准年份：
    2016
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2017-01-01 至2020-12-31

项目摘要

Recently, the repressing transcription factor BCL11A was found as a critical regulator of γ- to β-globin gene switching, with a binding site within a 3.5kb region at the 5' upstream of δ-globin gene. However, the precise binding site of BCL11A is unclear. CRISPR/Cas9 system as a genome editing tool developed quickly in recent three years, and has the advantages of high through-put and high accuracy for functional screening of genes. In this project, all feasible sgRNAs within the 3.5kb region at the 5' upstream of δ-globin gene will be designed, and lentivirus sgRNA library will be constructed. CD34+ haemopoietic stem cells will be transduced with sgRNA lentivirus followed by induced erythroid differentiation. Populations of cells with high and low expression of HbF will be sorted by FACS. sgRNAs related to high expression of HbF will be identified by deep sequencing, and the precise binding site of BCL11A can be determined subsequently. Finally, the BCL11A-binding site specific mutation via CRISPR/Cas9 system will be performed to validate its function in repressing the expression of HbF. The results of this study will be benefit to further elucidate the molecular mechanism of γ- to β-globin gene switching, and provide new gene therapy target for β-thalassemia.
近年发现转录抑制因子BCL11A是γ→β珠蛋白基因转换过程中起关键作用的调节因子，其结合位点在δ珠蛋白基因5'端上游3.5kb范围内。然而，BCL11A的准确结合位点目前尚不清楚。CRISPR/Cas9系统最近3年迅速发展起来的基因编辑技术，在功能基因筛选方面具有通量大、准确性高的优势。本项目在δ珠蛋白基因5'上游3.5kb的区域内设计出所有可行的sgRNAs，构建sgRNAs慢病毒文库。CD34+造血干细胞感染sgRNAs慢病毒后向红系定向诱导分化。FACS分选出HbF高表达和低表达的细胞群，再用高通量测序鉴定出与HbF高表达相关的sgRNAs，从而推断出BCL11A的准确结合位点，并验证其抑制HbF表达的功能。本项目的研究结果将有助于进一步阐明γ→β珠蛋白基因转换过程的分子机制，同时为重型β-地贫的基因治疗提供了新的靶点。

结项摘要

重新激活成人体内已经沉默的γ-珠蛋白的表达从而治疗遗传性疾病β-地中海贫血是近年来的研究热点之一，以往研究报道HBD基因上游3.5kb区域与HbF的表达相关。我们设计了这一区域内所有的sgRNA并构建了CIRSPR质粒文库，经过NGS测序鉴定文库合格后构建了慢病毒文库。我们将CRISPR文库慢病毒感染HUDEP-2细胞并用流式分选出HbF表达最高和最低的细胞各10%，经过NGS测序获得了δ-珠蛋白基因上游3.5kb范围内所有sgRNA位点与HbF表达的关系。我们验证了与HbF表达相关的sgRNA位点，其中2个sgRNA（sgLIB6，sgLIB7）对HBG有促进作用，为β-地贫的基因治疗研究提供了新的靶点。本项目还对BCL11A红系特异增强子+58和BCL11A在γ-珠蛋白启动子区的结合位点进行了单独和联合编辑，在mRNA表达和蛋白表达水平，联合编辑对HBG的促进效果均明显优于单独编辑，这种联合编辑的策略为β-地贫的基因治疗提供了一个新的思路。

项目成果

期刊论文数量（7）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
贵阳地区育龄人群HbA_2筛查轻型β-地中海贫血截断值的确定
  • DOI：
    10.19367/j.cnki.1000-2707.2017.10.002
  • 发表时间：
    2017
  • 期刊：
    贵州医科大学学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    韩文平;王树辉;徐琴;杨楠楠;韩媛媛;黄凌;黄盛文;安邦权
  • 通讯作者：
    安邦权
慢病毒介导炭疽毒素受体1基因靶向沉默对γ珠蛋白基因表达的影响
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2018
  • 期刊：
    发育医学电子杂志
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    徐琴;李贵芳;金婷婷;李頔;熊永红;安邦权;黄盛文
  • 通讯作者：
    黄盛文
足月儿与早产儿脐血有核红细胞基因组DNA甲基化差异分析
  • DOI：
    10.19746/j.cnki.issn1009-2137.2020.03.037
  • 发表时间：
    2020
  • 期刊：
    中国实验血液学杂志
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    杨楠楠;罗振元;周曼;林虹;王薇;黄盛文
  • 通讯作者：
    黄盛文
Association of polymorphisms in the HBG1-HBD intergenic region with HbF levels
HBG1-HBD 基因间区域多态性与 HbF 水平的关联
  • DOI：
    10.1002/jcla.23243
  • 发表时间：
    2020-02-18
  • 期刊：
    JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS
  • 影响因子：
    2.7
  • 作者：
    Hu，Li;Huang，Ling;Huang，Shengwen
  • 通讯作者：
    Huang，Shengwen
贵阳地区育龄人群HbA_2和HbF参考范围的研究
  • DOI：
    10.19367/j.cnki.1000-2707.2017.10.001
  • 发表时间：
    2017
  • 期刊：
    贵州医科大学学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    韩文平;王树辉;杨楠楠;徐琴;韩媛媛;黄凌;黄盛文;安邦权
  • 通讯作者：
    安邦权

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其他文献

贵州地区β-地中海贫血基因突变类型分析
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2014
  • 期刊：
    中华医学遗传学杂志
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    李贵芳;吴娴;王茹蕾;黄盛文
  • 通讯作者：
    黄盛文

其他文献

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黄盛文的其他基金

ANTXR1通过Wnt/β-catenin信号通路调控γ珠蛋白基因表达机制的研究
  • 批准号：
    81960040
  • 批准年份：
    2019
  • 资助金额：
    34 万元
  • 项目类别：
    地区科学基金项目
基于RNA-Seq技术的γ→β珠蛋白基因开关过程中转录组变化的研究
  • 批准号：
    81260089
  • 批准年份：
    2012
  • 资助金额：
    50.0 万元
  • 项目类别：
    地区科学基金项目

相似国自然基金

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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