miRNA在茄科植物抗性反应中的作用机理

Plant disease resistance genes (R gene) play an important role in protecting plants from pathogen attack and are essential for ensuring high crop yeild. However R gene mediated resistance is race specific. In order to meet the challenge posed by enormous number of pathogens, plants evolved handreds even thousands of R genes during their co-evolution with pathogens. While R genes are normally expressed at very low level, ectopic expression of R genes usually results in severe developmental phenotype, which suggests R genes must be tightly regulated. In the past deca, miRNAs and siRNAs are widely recognized as an ubiquitous gene regulator in almost all eukaryotic organism. We and other lab recently identified a number of both conserved and non-conserved miRNAs that target important functional R genes. We also discovered that these miRNA also trigger secondary siRNA synthesis using tasiRNA pathway to reinforce silencing of R genes. These work opened up a new revenue to study the role and machinsm of miRNA and siRNA mediated regulation in disease resistance. We propose to combine genetic, molecular and bioinformatics approaches address these questions and we will futher investigate the possible evolution origin of the R gene targeting miRNA and the potential miRNA mediated regulatory network in disease resistance. Our project will provide significant insights on the role of miRNA and siRNA during host-pathogen interaction and contribute to crop improvement.

抗病基因对于植物抵御病原生物的入侵、保证作物的高产稳产有着重要的作用。抗病基因与病原作用的特异性很强，为了应对多种病原生物的挑战，植物在进化过程中产生了成百上千的抗病基因，但同时这些抗病基因也对植物的生长发育带来了潜在的危险。抗病基因正常情况下表达量都很低，说明它们的表达被严格的控制，但是其机理不清楚。近几年来，miRNA和siRNA对基因的表达调控广泛关注和研究。它们是普遍存在于真核生物中的重要的基因表达调控机制。我们最近发现一些重要的抗病基因都受miRNA和siRNA调节。本项目将综合运用遗传学，分子生物学和生物信息学的手段，来深入研究miRNA和siRNA对抗病基因的调控机理。我们还将全面的鉴定和验证烟草中的miRNA和靶基因，研究它们在抗病反应中的调控网络。本项目的研究将极大地加深对miRNA和siRNA在宿主和病原互作中的作用的认识为培育抗病作物打下理论基础

抗病基因是高等植物特有的一个基因家族。它们能特异性的识别某些病原微生物, 并在大多数情况下通过过敏反应来抑制病原微生物的扩散,从而为植物提供保护。但是抗病基因的表达和功能必须受到严格的调控，否则会在没有病原入侵的情况下激活抗病反应从而使植物的发育异常甚至死亡。在前期的研究中我们发现植物基因组中存在大量的miRNA基因，它们以抗病基因为靶基因，在没有病原入侵时抑制抗病基因的表达以降低抗病基因对植物发育的不良影响。我们通过5末端RACE实验验证了miR6019, miR6020等对烟草花叶病毒（TMV）抗病基因N的剪切作用，并通过瞬时表达体系初步验证了这些miRNA对N基因功能的抑制作用。本课题的一个重要内容是构建miR6019/miR6020的过表达转基因烟草株系，并与含有N基因的转基因烟草株系TG34杂交，初步的TMV侵染试验表明在稳定的转基因株系中过表达miR6019/miR6020也可以抑制N基因的抗病功能。本课题同时构建了表达N-GFP融合蛋白的转基因烟草并初步筛选出了一些对TMV抗性较好的株系。本课题的另一个重要内容是研究了一个新的TAS5基因生成tasiRNA的机制及其对马铃薯X（PVX）的抗病基因Nb的调控作用。通过高通量测序和生物信息学分析我们发现TAS5的转录本受miR482d的切割然后在RNA聚合酶RDR6的作用下生成双链RNA并在DCL4的作用下进一步切割成tasiRNA。我们的降解组测序和基因特异性的RACE实验证明了马铃薯TAS5产生的3’D13（-）tasiRNA对Nb基因及其同源体的mRNA有剪切作用。应用BLASTN序列比对分析还表明TAS5基因与靶基因具有同源性，这一点跟miR6019/miR6020的前体相似。我们的研究表明小分子RNA对抗病基因的调控具有普遍的意义，同时还表明抗病基因的进化跟调节其功能的小分子RNA基因有密切的联系。抗病基因可以看作是植物进化过程中为自己打造的防御病害的利剑，而调控抗病基因的小分子RNA则是植物在打造抗病基因的同时用相同的材料为利剑铸就的剑鞘来保护自身免受利剑的伤害。本研究为植物基因组的进化和非编码基因的进化机制等方面提供了经典的案例。

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