副粘病毒融合蛋白连接区介导膜融合的分子机制

Paramyxoviruses are important pathogenic viruses for human beings and animals. The entry of paramyxoviruses into cells requires the merger of viral and cellular membranes and formation of cell fusion is a key pathological characteristic of viral infection. For most paramyxoviruses, the fusion protein(F) alone cannot mediate fusion; it requires coexpression of the homologous haemagglutinin-neuraminidase protein. A linkage is not only the bridge and tie between domains of F protein, but the channel of information transmission between them. The domain between HR1 and HR2 interacts with the fusion peptide. It has also been found that conserved amino acids in three domains, D1, D2 and D3, play an important part in F protein-mediated membrance fusion. However, it has not been reported whether the linkages impact on F protein-mediated membrance fusion or not. To explore the role of linkages in F protein-mediating membrance fusion, we are going to study the function of three linkages of F protein，using human parainfluenza virus type 3(hPIV3) and Newcastle disease virus(NDV) as models, by deleting, mutating and substituting amino acids in the linkages. Meanwhile, we are going to design synthetic peptides containing L1 to provide a new strategy for studying antiviral mechanism by synthetic peptides and further to know the mechanism of cell fusion.

副粘病毒是人类及动物的重要致病病毒。病毒包膜与宿主细胞膜的融合和细胞之间的膜融合是副粘病毒感染宿主细胞的关键步骤和重要病理特征，此过程是在同源性血凝素-神经氨酸酶（HN）协助下，由病毒包膜融合蛋白（F）介导下完成的。连接区是F蛋白结构域连接的桥梁和纽带，同时也是结构域相互传递信息的通路。目前认为，HR1与HR2之间的区域（包括D1，D2，D3结构域和连接区L1，L2和L3）与融合肽存在相互作用，D1，D2和D3区域内的保守氨基酸对F蛋白介导细胞融合功能至关重要。而连接区在F蛋白介导细胞融合过程中发挥何种作用尚不清楚。本课题拟以人副流感病毒3型（hPIV3）和新城疫病毒（NDV）为模型，通过连接区缺失、突变和替代三种方法研究F蛋白三个连接区在F蛋白介导细胞融合机制中的作用。同时拟设计含有连接区L1的合成肽，在为研究合成肽抗病毒作用机制提供新思路的同时，进一步探索细胞融合的发生机制。

病毒包膜与宿主细胞膜之间的融合以及细胞之间的膜融合是副粘病毒感染宿主细胞的关键步骤和重要病理特征，此过程是在同源性血凝素-神经氨酸酶（HN）协助下，在病毒包膜融合蛋白（F）介导下完成的。连接区是F蛋白结构域连接的桥梁和纽带，同时也是结构域相互传递信息的通路。而连接区在F蛋白介导细胞融合过程中发挥何种作用尚不清楚。本课题以人副流感病毒3型（hPIV3）和新城疫病毒（NDV）为模型，通过连接区缺失、突变和替代三种方法研究F蛋白三个连接区在F蛋白介导细胞融合机制中的作用。同时设计含有连接区L1的合成肽，在为研究合成肽抗病毒作用机制提供新思路的同时，进一步探索细胞融合的发生机制。.本课题构建了针对hPIV3 F蛋白连接区的26个点突变体、6个嵌合体和2个缺失体，然后检测各突变体、嵌合体、缺失体的蛋白表达效率，蛋白的折叠与加工情况，细胞融合活性以及与同源性HN的相互作用。结果显示， hPIV3 F蛋白DI-DII连接区对膜融合功能有重要影响，且各氨基酸残基对F蛋白介导的细胞融合的影响并不完全相同，K369E、S370A、V373A、V373T 和 P374T突变体的膜融合活性均低于野生型水平的19%，而K369A、D371A、I372A 和P374A突变体的膜融合活性均略大于野生型水平的50%。且膜融合活性的降低可能是由于突变导致各突变体F蛋白与同源性HN蛋白在细胞表面的相互作用能力降低所致。hPIV3 F蛋白DI-DIII伪连接区的亮氨酸拉链类似结构对膜融合活性有重要影响:3个单点突变体（L257A、L271A 和I299A）和3个二联突变体的膜融合能力极度降低，其中三联突变体对膜融合活性的影响最大；该结构的完整性是完成膜融合过程必不可少的。hPIV3 F蛋白HRB连接区内的氨基酸突变对细胞融合活性有重要影响，其中N446为关键氨基酸位点。hPIV3 F蛋白的DI-DII连接区（L1区）和HRB连接区（L3区）嵌合体与缺失体：NDV-L1、NDV-L3、MV-L1、MV-L3、hPIV1-L1、 hPIV1-L3D-L1、D-L3。膜融合能力检测发现只有hPIV1-L1、 hPIV1-L3仍保留部分融合活性，其他突变体融合能力几乎完全丧失。.除此之外，还开展了HN蛋白头部保守氨基酸、头颈连接区、头颈相互作用面等与课题相关的研究。

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