GmPAP4和GmPAP33调控大豆-AM共生体内磷再利用的生理和分子机制

Soybean is an important food and oil crop. Efficient P acquisition and utilization could be considered as a critical strategy for improving soybean yield. Both purple acid phosphatases (PAPs) and arbuscular mycorrhizae (AM) play very important roles in enhancing soybean P efficiency. However, it is seldom reported that AM can specifically induce/enhance the expression of some plant purple acid phosphatase genes under low P condition. The possible mechanism is the involvement of GmPAP4 and GmPAP33 in the metabolism of Poly-P and organic P during senescence and degeneration of arbuscules. In this project, firstly, the over-expressing and RNAi transgenic plants will be employed to elucidate the physiological mechanism of P hydrolysis and re-utilization regulated by GmPAP4 and GmPAP33 in soybean-AM symbiotic system. Subsequently, the biochemical properties of GmPAP4 and GmPAP33 will be analyzed to obtain their active proteins by either bacteria or yeast heterologous expression systems. Moreover, the responses of GmPAP4 and GmPAP33 to low P and AM signals will be analyzed by double localization of promoter with both GUS and AM structure staining. The results might elucidate the physiological and molecular mechanisms of GmPAP4 and GmPAP33 regulating phosphorous re-utilization in soybean-AM symbiosis. Our project plans to publish 2-3 scientific manuscripts, submit 2-3 P-efficient soybean materials, and train 3-4 graduate students.

大豆是重要的粮油兼用作物。高效吸收利用磷是提高大豆产量的重要途径。丛枝菌根（AM）和紫色酸性磷酸酶（PAP）均对提高作物磷效率至关重要，然而，丛枝菌根能特异诱导缺磷植物部分酸性磷酸酶基因表达增强还鲜有报道, 其机理可能是参与了丛枝衰老降解过程中释放的多聚磷和有机磷的代谢。本项目首先利用已获得的GmPAP4和GmPAP33过量和干涉大豆转基因株系，研究其调控大豆-AM共生体内磷水解再利用的生理机制；接着，通过细菌或酵母异源表达系统，明确其最适反应底物；并构建其启动子融合GUS的表达载体，获得整株转化株系进行GUS和菌根结构染色的组织双定位分析，揭示GmPAP4和GmPAP33在大豆中响应低磷和菌根信号的方式，从而阐明其调控大豆-AM共生体内磷再利用的生理和分子机制。本项目预期可发表高水平学术论文2-3篇，提交磷高效转基因大豆新材料2-3份，培养研究生3-4名。

高效吸收利用磷是提高大豆产量的重要途径。丛枝菌根（AM）和紫色酸性磷酸酶（PAP）均对提高作物磷效率至关重要，然而，丛枝菌根能特异诱导缺磷植物部分酸性磷酸酶基因表达增强还鲜有报道, 其机理可能是参与了丛枝衰老降解过程中释放的多聚磷和有机磷的代谢。本项目首先Real-Time PCR技术分析了GmPAP4和GmPAP33在短、长期低磷诱导条件下不同部位对磷胁迫的响应。结果表明，GmPAP4和GmPAP33在低磷处理12天的幼叶、老叶和根部表达量最高，并且，其表达在AMF侵染的根中明显增强，但表达受基因型和菌根真菌菌种影响较小。其次，通过根癌农杆菌介导的大豆子叶节整株转化法成功获得转GmPAP33启动子的整株转化材料；通过接种AMF的染色结果显示，在接菌和不接菌处理下，GmPAP33 在根、叶和花等多个组织中都有表达；对内皮层细胞的观察发现，GmPAP33主要定位在含有丛枝的内皮层细胞内。而洋葱和烟草叶表皮细胞的亚细胞定位研究发现，GmPAP33主要定位于细胞膜和胞质内。进一步利用昆虫异源表达系统，获得了有活性的GmPAP33蛋白，并进行了生化特性分析。结果表明，GmPAP33的最适底物为甘油磷脂酸，磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油。最适pH值为4.0，最适温度为50°C。Mg2+，Mn2+对GmPAP33的酶活有促进作用，而一些阳离子会抑制其酶活。而转基因大豆的土培试验结果显示，接种AM真菌显著促进大豆生长，在加磷接种AM真菌处理时，过量表达GmPAP33能增加大豆的产量和吸磷量。与对照大豆WT相比，过量表达转基因植株OE1和OE2的荚干重分别增加了31.08%和30.95%。进一步对菌根侵染结构观察发现，在野生型、过量表达和RNAi干涉株系中，丛枝结构大小比率存在显著差异。通过对根部不同形态磷的测定发现，在接种AMF处理时，GmPAP33可能参与菌根内有机磷脂磷酸盐的再利用。本项目在国际上首次揭示了紫色酸性磷酸酶参与菌根共生系统中丛枝降解的新功能，有较大的理论突破。本项目现已发表第一标注的高水平学术论文2篇，在投1篇；获得可提交的磷高效转基因大豆新材料2份，；申请了发明专利1项；培养硕士、博士研究生共4名。

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