XsfP催化的膜内受控蛋白水解在黄单胞菌致病过程中的调控功能

Proteolysis is one of the molecular modes in signal transduction of eukaryotic and prokaryotic cells. The process is tightly regulated by multiple hierachical levels. Among them, regulated intramembrane proteolysis (RIP) is catalyzed by various proteases and taken ocurred within membrane. RIP is also a frontier in studying cell signaling. Our previous investigation has found that inactivation of a gene encoding a Site-2 family RIP protease, xsfP, resulted in significant attenuation of virulence of a plant pathogen, Xanthomonas campestris. In addition, mutation in xsfP also increased the susceptibility of the muant when grown under various stress conditions, suggesting XsfP is a critical regulator for bacterial adaptation. To decipher molecular mechanism of XsfP-mediated RIP in regulating bacterial physiology, this project aimed to 1) employ technology of affinity proteomics to screen and identify candidate physiological substrates of XsfP; 2) investigate the molecular recognition between XsfP-substrate and the proteolytic processes in terms of the cleavage site, enzymatic dynamics and specificity of XsfP; 3) study the regulatory process and mechanism of XsfP-triggered bacterial pathogenesis and environmental adaptation. Since XsfP is the first experimentally identified RIP protease in plant pathogenic bacteria, the results of this project will give insight into our understanding in bacteria-host interaction that is controlled by RIP, and will facilitate the development of novel antibacterial strategy using RIP as molecular targets.

蛋白质水解是真核与原核细胞信号转导的重要分子模式，受多种水平的严格调控。其中，膜内受控蛋白水解（RIP）是近年发现的一种由蛋白酶催化，在细胞膜内部水解重要功能蛋白的方式，也是本领域研究的前沿。前期研究发现，病原细菌野油菜黄单胞菌中一个Site-2家族的膜内蛋白酶基因xsfP突变后，细菌在寄主上的致病力显著下降并对多种环境胁迫敏感，表明该基因是控制细菌致病力和适应性的关键因子。为探索XsfP催化的RIP调控机制，项目将1）在精细遗传分析基础上，利用亲合蛋白质组学方法筛选和鉴定XsfP的生理学底物；2）分析XsfP－底物相互作用过程中，XsfP识别底物的分子机制、RIP位点、酶反应动力学过程和XsfP酶切反应的特异性；3）阐明膜内蛋白水解在细菌致病和适应环境胁迫过程中的调控途径和机理。项目结果将为理解不可逆信号转导过程在病原细菌－寄主相互作用过程中调控细菌代谢行为提供新的证据。

蛋白质水解是真核与原核细胞信号转导的重要分子模式，受多种水平的严格调控。其中，膜内受控蛋白水解（RIP）是近年发现的一种由蛋白酶催化，在细胞膜内部水解重要功能蛋白的方式，也是本领域研究的前沿。前期研究发现，病原细菌野油菜黄单胞菌中一个site-2家族的膜内蛋白酶基因xsfP突变后，细菌在寄主上的致病力显著下降并对多种环境胁迫敏感，表明该基因是控制细菌致病力和适应性的关键因子。为探索XsfP催化的RIP调控机制，本项目的研究内容为:1)完成xsfP参与致病力和胁迫反应的精细遗传学分析。利用突变分析，完成了包括操纵子结构分析，xsfP基本表达模式分析，重要结构域和功能位点的精细遗传分析；2)完成XsfP酶切底物的亲合蛋白质组学筛选及鉴定。包括构建用于TAP筛选的重组菌株；利用亲合蛋白质组学，系统筛选野油菜黄单胞菌中S2P蛋白酶XsfP的生理学底物；体内外分别验证结合蛋白；3)完成XsfP酶切底物过程的酶学分析及特异性分析。包括XsfP蛋白酶体外表达及纯化；通过对XsfP活性位点的遗传分析，初步探索XsfP发挥活性的分子机理。.获得的重要结果和关键数据如下：.1）.遗传证据证明site-2家族蛋白酶基因xsfP参与致病和胁迫反应过程；.2）.建立了TAP筛选体系并获得初步结果；.3）.获得XsfP全长及截短形式的蛋白可用于后续分子生物学实验；.4）.筛选并体内外鉴定XsfP生理底物。.项目结果表明，用串联亲和层析的技术筛选位于细菌细胞膜的S2P蛋白酶底物并不是一个切实可行的方法，同时依然提示不可逆信号转导过程在病原细菌－寄主相互作用过程中调控细菌代谢行为具有重要作用，值得继续探索。

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