水稻杂种花粉不育基因的图位克隆与机理研究

Cultivated rice (Oryza sativa L.) comprises two subspecies, indica and japonica rice. Indica-japonica intersubspecific hybrid rices have stronger heterosis than intrasubspecific ones, whereas intersubspecific reproductive isolation hampers the utilization of indica-japonica hybrid rice. f5 is among the loci with the largest effect on hybrid pollen fertility. We will isolate genes at f5 via map-based cloning, and elucidate the biological mechanism leading to f5 hybrid abortion. We have developed comprehensive near-isogenic lines (NILs), using different materials (indicas, japonicas and wide compatibility varieties) as f5 donor and recipient respectively. Hybrid sterility of f5 is continuously treated as a single-gene-controlled trait, without target genes having been identified. Genotypes in progeny of indica-japonica heterozygote at f5 does not meet Mendelian segregation ratio, showing significant segregation distortion (SD). Research shows that induction of hybrid SD needs at least two genes (or two different copies located in different positions of the same gene), and there should be more than a single gene involved in f5 effect. For polygenic trait, different mapping population can direct to different genes with respective function. Our numerous f5 NILs can meet the needs of fine mapping and functional validation of all target genes. f5 has been mapped to two candidate genes, and validation of gene function is under way. Results will improve our understanding on origin, evolution and genetic diversity formation of rice, and would also contribute to intersubspecific hybrid rice breeding.

栽培稻包含籼稻和粳稻亚种。籼粳亚种间杂交稻的优势比品种间的更强，但亚种间生殖隔离妨碍了籼粳杂交稻的利用。f5是对杂种花粉育性影响最大的位点之一。拟对f5位点进行基因图位克隆，并阐明f5导致杂种败育的生物学机理。用不同的材料（籼稻、粳稻、广亲和品种）作为f5供体和受体构建了较为全面的近等基因系。f5杂种不育一直被当做单基因控制的性状，还没有确定目标基因。f5籼粳杂合体后代的基因型分离不符合孟德尔遗传分离比，存在极显著的偏分离。研究表明，至少两个基因（或同一基因位于不同位置的两个不同拷贝）参与才能导致杂种偏分离，故f5应该不止单个基因参与。对多基因控制性状，采用不同群体可以定位到不同功能的基因，我们拥有的众多f5近等基因系可以满足精细定位和基因功能验证的需要。已把f5定位到两个候选基因，正进行基因功能验证。此研究将增进对稻种起源、演化、遗传多样性形成等科学问题的认识，也会有助于亚种间杂交稻育种

f5位点是影响水稻籼粳杂种雄性不育和偏分离的主要位点。BC14F2群体中，粳型纯合（f5-j/j）、籼粳杂合（f5-i/j）和籼型纯合（f5-i/i）单株的花粉育性分别为95%、53%和97%。f5籼粳杂合时表现为花粉半不育，但结实率正常（意味着雌配子育性不受影响）。三种基因型的分离比为7:84:80，与孟德尔分离比1:2:1存在显著差异，暗示粳型配子的选择性败育导致偏分离。为了探索f5位点杂种雄性不育的分子生物学机理，我们利用RNA-Seq技术对三种基因型植株进行了转录组水平的比较分析。差异表达基因的富集分析显示，跟胁迫响应、活性氧以及细胞周期相关的BINs和GO条目发生富集。调节活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）平衡的关键基因APX（Ascorbate Peroxidase，）以及许多对蛋白质起保护作用的热激蛋白基因（Heat Shock Proteins，HSPs）的表达量均明显下降，这会导致花粉细胞对各种胁迫更加敏感。基于以上结果，我们提出f5位点水稻籼粳杂种雄性不育的分子调控模型：f5位点在籼粳杂合情况下，激发一系列胁迫反应并抑制APX和HSP表达；APX基因表达量下降破坏了细胞内ROS的动态平衡导致氧胁迫，氧胁迫对细胞内的蛋白质和核酸等生物大分子造成损伤；HSPs可以保护细胞内的大分子免受损伤，本研究中大量HSPs的表达量在花粉败育的植株中下降，最终导致花粉细胞败育。为确定f5位点的杂种不育基因，构建了f5位点两个候选基因ORF1、ORF2的CRISPR/Cas9敲除载体，并利用农杆菌介导的遗传转化方法，对目标基因的粳型和籼型等位基因分别进行敲除。ORF1-j、ORF2-j、ORF1-i、ORF2-i分别获得16、14、7、4株突变单株。候选基因的比较测序结果表明，f5-i/i和f5-j/j在 ORF1基因存在多处差异，包括10个单核苷酸多态性，3处单碱基插入或缺失。其中7个SNP位于基因的编码区，导致编码的蛋白质间7个氨基酸残基的差异。f5-i/i和f5-j/j在ORF2区段存在7个SNP差异，其中5个SNP位于编码区，造成4个氨基酸残基的差别；另两个SNP位于非编码。细胞学观察表明，在减数分裂二分体时期，跟纯合基因型植株相比，杂合基因型植株花药壁上的绒毡层提前解体。

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