原理设计用于基因编辑和表达调控的缩小版CRISPR/Cas系统

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) technology has been widely employed in genome editing and transcription control. However, delivery of the CRISPR/Cas9 system along with variant effector domains in a single adeno-associated virus (AAV) remains challenging due to the payload limit. In this project, we aim to engineer a set of downsized Cas9 variants (mini-Cas9) that retained DNA binding activity by deleting conserved functional domains. We will also study different strategies to optimize the gRNA expression unit and downsize the fusion domains and control elements. The success of this project will provide a practical approach to generate a compact CRISPR/Cas system for gene editing and transcription control, which will facilitate the development of an all-in-one AAV-CRISPR/Cas9 system with different effector domains for a diverse in-vivo applications.

来源于细菌和古细菌的CRISPR/Cas9系统已广泛应用于基因编辑和基因表达调控。然而，由于腺相关病毒载体容量的限制，融合不同功能作用域的CRISPR/Cas9系统的递送仍然面临挑战。在本项目中，我们将研究删除Cas9蛋白的不同功能作用域对其DNA结合能力和DNA切割能力的影响，从而构建出一系列只具有DNA结合能力的缩小版Cas9（mini-Cas9）。我们将研究mini-Cas9与不同功能作用域融合后的DNA切割、点突变和转录激活的效率，研究如何优化缩小gRNA表达单元，以及其他融合作用域和控制单元，并将不同功能的CRISPR/Cas系统构建到一个腺相关病毒载体中。本项目的顺利进行，将帮助建立用于基因编辑和表达调控的缩小版CRISPR/Cas9系统，便于构建一体式的AAV-CRISPR/Cas9病毒递送技术体系，为拓展CRISPR/Cas技术的医学应用提供新的技术途径。

近年来CRISPR/Cas9系统已被工程改造用于基因和碱基编辑，以及基因表达调控，在基因治疗和功能基因组学研究中展现了广泛的应用前景。然而，目前的CRISPR/Cas9系统在腺相关病毒载体递送、可靶向的DNA序列范围等仍有局限。申请人课题组研究了删除SaCas9蛋白的不同功能作用域对其DNA结合能力和DNA切割能力的影响，并构建了一系列只具有DNA结合能力的缩小版Cas9（mini-Cas9）。我们将mini-Cas9与缩小的转录激活作用域融合，与gRNA表达单元构建到一个腺相关病毒载体中，将CRISPR/Cas系统递送到哺乳动物细胞中，实现了基因转录激活。本研究建立的用于基因编辑和表达调控的缩小版CRISPR/Cas9系统，便于构建一体式的AAV-CRISPR/Cas9病毒递送技术体系，为拓展CRISPR/Cas技术的医学应用提供了新的技术途径。.此外，为克服SaCas9的PAM识别序列限制，申请人开展了基于进化信息拓展SaCas9蛋白PAM识别能力的研究。我们将Cas9同源蛋白中与PAM结合的作用域替换到SaCas9中，构建了33种嵌合型SaCas9（cCas9），将SaCas9的PAM识别覆盖度由原来的1/16扩展到了1/4，增加了SaCas9用于基因治疗的实用性。.最后，为了克服黑色素瘤细胞对威罗菲尼耐药性的问题，申请人课题组建立了一套基于双sgRNA的遗传相互作用高通量研究方通过高通量筛选实验，我们找到三种使癌细胞对MAPKi敏感的协同作用基因组合，并利用竞争生长、细胞活力和癌细胞成球实验验证了三种基因组合的功能，为阐明癌细胞对MAPKi的耐药性提供了系统的见解。其中，靶向ITGB3和IGF1基因组合的药物连用（cilengitide+linsitinib），可作为抑制MAPKi应激条件下HDGF-LGR5蛋白复合物适应性形成的候选干预手段。

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