新型链霉菌调控因子Med-ORF10参与抗肿瘤抗生素美达霉素生物合成的生物学机制

聚酮抗生素美达霉素具有强抗肿瘤活性，其生物合成调控非常复杂。调控因子在抗生素生物合成研究和高产菌遗传育种方面具有重要的研究价值和应用潜力。同源性分析推测美达霉素生物合成基因簇中的med-ORF10编码一种作用机制未明的新型调控因子，可能具有更新颖的作用机理。前期实验证据初步表明它可能参与美达霉素生物合成调控。本项目拟在已有的研究基础上，进一步验证其调控功能，并展开初步的机理研究：（1）通过超量表达、基因敲除和互补实验确定med-ORF10是否调控美达霉素生物合成；（2）通过RT-PCR等实验确定med-ORF10是否在转录水平上发挥功能以及在美达霉素基因簇中的调控靶点；（3）利用凝胶阻滞实验确定med-ORF10是否直接作用于这些调控靶点；（4）结合DNase I印迹、免疫共沉淀等实验来初步推断其作用机制。本项目将为抗生素生物合成调控研究和高产菌遗传育种提供重要理论依据并积累优势基因资源。

链霉菌来源的抗生素生物合成受到多种调控因子的控制，调控机制呈现多样化，其中有一些机制未知的调控因子参与。美达霉素能以一种新颖的烷化机制阻遏肿瘤细胞中的信号传导，可有效抑制多种肿瘤细胞的发生、发展和迁移。其生物合成基因簇中存在的基因med-ORF10推测编码一个新型调控蛋白，但与机制已知的调控蛋白无同源性，可能代表新颖的调控机制，且在同类抗生素基因簇中广泛存在。本项目首先对这个基因med-ORF10进行了超量表达、种间互补、基因敲出、基因回补等试验，结果表明：（1）med-ORF10作为一个调控基因参与美达霉素的生物合成；（2）med-ORF10不仅控制终产物美达霉素的产量，中间产物（经结构鉴定为抗生素kalafungin)的产量也受到调控；其次，本项目利用RT-PCR以及Western Blot等技术确定这个调控基因在美达霉素生物合成途径中的调控靶点，结果表明：（3）在美达霉素基因簇中存在多个med-ORF10的调控靶基因；（4）这些靶基因在转录水平上受到med-ORF10不同程度的调控，其中主要靶基因包括med-ORF12（经基因敲出和互补实验证明编码立体专一性酮基还原酶，参与美达霉素的手性中心结构形成）和med-ORF11（基因敲出和超表达实验证明为SARP家族调控蛋白）；接下来，本项目对目的基因med-ORF10进行原核表达纯化，对美达霉素基因簇中靶基因启动子进行活性检测，并利用纯化的蛋白Med-ORF10与靶基因启动子进行EMSA实验以及与链霉菌DNA进行染色质免疫共沉淀，结果表明：（5）蛋白Med-ORF10在溶液中以多聚体形式存在；（6）目前未检测到目的蛋白Med-ORF10与美达霉素基因簇中靶基因启动子有结合活性；也未检测到野生菌的基因组DNA与其有结合活性（生物信息学分析表明Med-ORF10无DNA-Binding结构域）。所以，根据这些数据推断调控蛋白Med-ORF10对美达霉素合成相关靶基因的表达调控不是通过DNA-蛋白互作。最后，建立了野生菌基因组的表达文库，利用酵母双杂交实验确定可能与Med-ORF10直接互作的蛋白，结果表明：（7）目前已鉴定了4个蛋白可能与Med-ORF10通过蛋白互作发挥作用（进一步验证实验在进行中）。另外还获得了蛋白Med-ORF10的晶体（分辨率达1.78Å）。本项目获批专利一项，发表中文论文两篇、外文论文5篇。

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