基底硬度（Stiffness）调控干细胞向角膜基质细胞分化及在角膜组织工程中的功能应用

Corneal tissue engineering is promising to solve the shortage of donor for corneal transplantation. Phenotype maintain of keratocytes is critical for the successful construction of tissue engineered cornea. However, the regulation system of inducing stem cells differentiating towards keratocytes is still unclear. Pilot study from the project applicant showed that physiological stiffness is beneficial for the phenotype maintain of cultured keratocytes, and cytoskeletal structure is different when keratocytes cultured on substrate with different stiffness. Rac1 inhibition by NSC23766 decreases keratocyte phenotype. Therefore, substrate stiffness may regulate keratocyte phenotype by Rac1 mediated cytoskeletal re-organization. The purpose of this project is to investigate the effect and mechanism of substrate stiffness in keratocyte phenotype maintain and differentiation. To achieve the purpose, this project will firstly evaluate the effect of substrate stiffness on the expression of keratocyte phenotype markers, as well as the mechanism involved. Based on that, the effect of substrate stiffness on keratocyte differentiation from PDLSCs will be further investigated. And finally, a tissue engineered cornea stroma will be constructed and its efficacy will be checked in vivo. In summary, this project tries to explore the importance of substrate stiffness in keratocyte differentiation and cornea tissue engineering. It facilitates to find the critical regulatory factors so as to promote the potential clinical applications of tissue engineered cornea.

稳定的角膜基质细胞表型是成功构建组织工程角膜解决角膜移植供体短缺的关键，但是目前干细胞向角膜基质细胞分化的调控体系尚不清楚。申请人的前期实验结果发现角膜基质生理学硬度有利于角膜基质细胞的表型维持，并且基底硬度会影响细胞骨架的形态结构。而细胞骨架装配开关Rac1的抑制剂NSC23766处理后，角膜基质表型下降。表明基底硬度可能通过Rac1改变角膜基质细胞骨架来调控细胞的表型。本项目将深入研究基底硬度对角膜基质细胞表型维持及分化的作用和机理。本项目将首先系统地研究基底硬度对角膜基质细胞的表型和多种细胞行为的调控作用及其内在机理，在此基础上探索基底硬度对牙周韧带干细胞向角膜基质细胞分化的调控作用，并构建组织工程角膜评估其体内原位移植的功效性。本项目将为干细胞向角膜基质细胞的分化调控和组织工程角膜的构建提供新的思路，从而为人工角膜的临床化应用奠定理论和实验基础。

稳定的角膜基质细胞表型是成功构建组织工程角膜解决角膜移植供体短缺的关键，但是目前缺乏对角膜基质细胞表型以及干细胞向角膜基质细胞分化的有效调控策略，相关调控机制尚不清楚。细胞的物理微环境，对细胞表型的维持和细胞命运的决定，具有非常重要的调控作用，近年来正受到越来越多的关注。本项目关注物理微环境中的基底硬度在角膜基质细胞表型维持及分化中的作用和机制。本项目评估了基底硬度对角膜基质细胞表型标记表达和不同细胞行为（包括细胞粘附、增殖和迁移）的影响和机制。发现生理性角膜硬度有利于维持角膜基质细胞表型。当角膜基质细胞在不同硬度的基底上培养时，其细胞骨架结构不同，这一过程由Rac1参与介导并影响细胞表型标记表达和细胞行为。本项目亦评估了基底硬度和炎症对角膜基质细胞表型的调节作用，以及干细胞向角膜基质细胞的分化。当细胞在软基质上培养时，发现炎症因子IL-1β对角膜基质细胞表型和分化有促进作用，这与在硬基质和TCP上培养的细胞不同。炎症因子和细胞微环境元素之间的相互作用导致了IL-1β对角膜基质细胞表型和分化的作用呈现硬度依赖性的双面作用。本研究还评估了基底硬度对羟基喜树碱（HCPT）调控角膜基质细胞转分化的影响。结果发现HCPT呈剂量依赖性抑制HTK细胞的增殖。此外，HCPT也可以抑制TGF-β1诱导的纤维化并促进角膜基质细胞表型，并且在硬基底上，这些作用更显著。本研究的结果强调了基底硬度对角膜基质细胞表型和分化的重要性，有助于更深入理解角膜病理过程、进一步优化角膜组织工程材料的选择，为减少角膜纤维化促进角膜再生提供了新的潜在策略。

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