蟾毒灵调控APOBEC3F介导的IgA生成相关肠道免疫网络抑制肝细胞癌侵袭转移的机制研究

Bufalin has been reported to inhibit the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma (HCC). However, the immnue mechanisms involved in are not clear. Our previous research revealed that APOBEC3F expression level in HCC cells is positively correlated with the migration ability of the cells. APOBEC3F mRNA overexpression in HCC tumor tissues could predict vascular invasion, intrahepatic metastasis, recurrence and poor survival in HCC patients. Additionally, bufalin could inhibit APOBEC3F expression. The biological functions of APOBEC3F in cancers have not been reported. Our bioinformatics analysis showed that APOBEC3F played a role in regulating intestinal immune network for IgA production signal pathway. Hence, we assume that APOBEC3F could active intestinal immune network for IgA production signal pathway, upregulate pIgR expression, which could induce epithelial-mesenchymal transition (EMT) in HCC cells. Given that, we hypothesize that bufalin could inhibit the invasion and metastasis of HCC via regulating intestinal immune network for IgA production signal pathway mediated by APOBEC3F. This study aimed to identify the expression pattern and function of APOBEC3F in HCC biological behaviour and to validate the role of APOBEC3F reduction in the anti-metastasis effect of bufalin. The results could be critical to reveal the new anti-metastasis mechanism of bufalin and provide evidence on the significance of bufalin’s effect in HCC treatment, also could illustrate the influence of APOBEC3F in HCC biological characteristics and the discovery of novel target of HCC therapy strategy.

蟾毒灵抑制肝癌侵袭转移的免疫机制研究较少。我们发现APOBEC3F与肝癌侵袭转移潜能相关，癌组织中APOBEC3F mRNA 的高表达是发生血管侵犯、肝内转移及肿瘤复发的危险因素，与患者预后呈负相关；其表达与肝癌细胞迁移能力成正相关，而蟾毒灵能够抑制APOBEC3F表达。APOBEC3F在肿瘤中的生物学功能未见报道，我们通过生物信息学分析发现其参与调控IgA生成相关肠道免疫网络。因此我们推测APOBEC3F可激活IgA生成相关肠道免疫网络，引起pIgR表达上调，诱导肝癌细胞的上皮间质转化，而蟾毒灵通过抑制APOBEC3F的表达抑制肝癌的侵袭转移。本课题将通过体内外实验明确APOBEC3F在肝癌细胞生物学行为中的作用及其参与介导蟾毒灵抑制肝癌侵袭转移的机制。研究结果将揭示蟾毒灵抑制肝癌侵袭转移的新机制，为其临床应用提供依据；阐明APOBEC3F对肝癌细胞生物学行为的影响，发现新的治疗靶点。

原发性肝癌高侵袭转移，预后差。蟾毒灵具有显著抗肿瘤效应，但其免疫调节机制研究较少。APOBEC3可不同程度的影响基因组的稳定性，诱导基因突变，促进肿瘤的发生发展。本研究拟探讨蟾毒灵调控APOBEC3F介导的IgA生成相关肠道免疫网络信号通路抑制肝细胞癌增殖迁移的机制。（1）结果发现APOBEC3F mRNA水平在肝癌组织中显著高于癌旁组织（p < 0.05）。癌组织APOBEC3F mRNA的高表达是肝癌出现血管侵犯、肝内转移、甲胎蛋白升高以及肿瘤复发的独立危险因素，与肝癌患者无病生存期呈负相关（p < 0.05）。在对SK-Hep1及Bel-7404细胞株进行APOBEC3F siRNA干扰24 h后，APOBEC3F siRNA组细胞数量明显低于对照组（p < 0.05）。CCK8细胞增殖实验表明，APOBEC3F siRNA干扰后，SK-Hep1及Bel-7404细胞株的增殖能力明显降低（p < 0.05）。划痕实验表明，APOBEC3F siRNA干扰后肝癌细胞迁移能力明显降低。siAPOBEC3F 可以降低 pIgR、CCR9、CCR10和CXCR4蛋白水平。蟾毒灵可有效抑制肝癌细胞增殖迁移能力。蟾毒灵抑制APOBEC3F表达从而使pIgR、CCR9、CCR10和CXCR4蛋白的表达降低。pIgR敲减C57BL/6小鼠皮下瘤体积明显低于对照组（p < 0.05）；pIgR过表达组肿瘤体积明显高于对照组（p < 0.05）。蟾毒灵干预pIgR过表达小鼠可有效抑制其肿瘤生长（p < 0.05）；同样，蟾毒灵作用于sh pIgR小鼠可显著抑制其皮下移植瘤生长（p < 0.05）。免疫组化结果显示pIgR过表达小鼠肿瘤组织中Ki67表达水平显著高于对照组（p < 0.05），pIgR敲减组小鼠肿瘤组织中Ki67的表达水平明显低于对照组（p < 0.05）。（2）pIgR mRNA及蛋白水平在肝细胞癌患者肿瘤组织中显著高表达（p < 0.05），pIgR高表达的患者发生肿瘤复发转移的风险更大（p < 0.05）。过表达pIgR的肝癌细胞Bel7404，其细胞增殖能力、迁移能力及侵袭能力显著增加。蟾毒灵可通过抑制pIgR的表达抑制肝癌细胞增殖迁移及侵袭能力。因此，蟾毒灵可通过调控APOBEC3F介导的IgA生成相关肠道免疫网络信号通路抑制肝细胞癌增殖迁移能力。

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