极端温度丝氨酸蛋白酶的适应机理

极端环境微生物的酶在生命有机体耐受极端物理化学因子过程中发挥着关键作用。目前还不清楚是何种因素使得极端温度酶在高温或低温环境下，即能保持结构稳定性和完整性，又具有高效的催化活性。选择丝氨酸蛋白酶为研究对象，以序列-结构-功能为主线，使用生物信息学、生物物理学、计算化学、分子生物学和生物化学相结合的手段，研究该酶家族中极端温度酶的耐受机理。通过分析、比较高温、常温和低温同源酶的结构特征，查明导致酶适应极端温度的结构因素；通过对酶结构在不同温度条件下的分子动力学模拟，确定导致酶结构稳定和活性保持的关键结构位点或区域；最后，对关键位点进行定点突变并测定、比较突变酶和天然酶的变性温度和催化动力学参数，明确极端温度酶的动力学性质与催化效率和热稳定性的关系，在原子水平上阐释极端温度丝氨酸蛋白酶的温度适应机理。本项目对认识生命与环境相互作用以及促进极端环境微生物资源在生物技术产业中的应用具重要意义。

极端环境微生物的酶在生命有机体耐受极端环境条件过程中发挥着关键作用，而研究极端酶的耐受机制则对认识生命与环境相互作用以及促进极端环境微生物资源在生物技术产业中的应用具重要意义。本项目的目标是鉴定、明确导致极端温度丝氨酸蛋白酶具有不同温度适应能力的结构或理化因素，并最终促进人们对极端温度丝氨酸蛋白酶温度适应机理的理解。用筛选到的耐低温（VPR）、常温(PRK)和耐高温(TRM)的“代表性”丝氨酸蛋白酶为研究对象，我们系统分析、比较了它们的序列和结构特征、动力学性质、高温解折叠路径、热稳定性和柔性、盐桥自由能、自由能图谱、以及溶剂温度对蛋白酶动力学行为的影响。主要结果为：(1)尽管VPR、PRK和TRM具有非常相似的三级结构，三者在Pro、Gly和带电残基（Asp、Glu、Lys、Arg ）的丰度、分布以及盐桥的数量和分布上存在差异；（2）在各自生理温度条件下三个酶的全局构象柔性之间并不存在显著差异，但是由于二硫键、Ca2+结合位点、盐桥以及甘氨酸和脯氨酸在结构分布上的差异，导致了三者在局部构象柔性上存在较大的差异，这可能是导致三者具有不同催化效率的关键因素；（3）低温酶VPR较常温酶PRK具有更高的最小全局自由能水平，更宽和更粗糙的自由能图谱；（4）高温条件下(373 K、473 K和573 K)，低温酶结构更不稳定，更容易解折叠且具有更快的解折叠速率；（5）疏水性（溶剂熵贡献）差异或许是导致三个蛋白酶全局结构稳定性不同的关键因素，而分子内非共价相互作用（焓贡献）的差异则是导致局部构象柔性不同的主要因素；（6）水分子与蛋白质表面原子（包括亲水和疏水原子）的相互作用对蛋白酶的结构稳定性、构象柔性和功能行使起着至关重要的作用，因此，如何优化这一相互作用以适应不同的温度条件，这或许是极端温度酶所采取共同分子策略。本项目研究所得到的结果对理解极端温度丝氨酸蛋白酶的稳定性-柔性-活性关系有重要意义。

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