猪瘟病毒与宿主蛋白的相互作用及调控病毒感染与复制的分子机制研究

为深入研究猪瘟病毒感染与致病的分子机制，本课题拟在已结题的"973"项目基础上，从病毒与细胞蛋白相互作用入手，采用免疫共沉淀、2-D电泳、蛋白印迹、质谱和激光共聚焦定位等技术，鉴定与揭示病毒重要功能蛋白（Erns、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B等）与细胞蛋白的互作网络，进而通过RNAi、表达细胞系构建、病毒蛋白亚细胞定位、病毒基因组复制分析以及常规病毒学方法分析细胞蛋白表达变化及相关信号通路对猪瘟病毒基因组复制、病毒蛋白合成与亚细胞定位、子代病毒包装与释放的影响，揭示宿主细胞蛋白调控猪瘟病毒感染与复制的分子机制，分析病毒/细胞相互作用对免疫系统和血管内皮系统靶细胞相关信号通路的影响。本研究对猪瘟病毒感染与致病分子机制的深度解析有助于开发新型疫苗和靶向预防制剂，具有重要的科学意义和应用价值。

猪瘟是严重影响我国养猪业高效安全养殖的传染病，为此，探索猪瘟病毒与宿主蛋白互作及其调控病毒感染和复制的机制、揭示我国当前流行毒株的遗传多样性、以及病毒蛋白翻译后加工的机制有助于猪瘟防控策略的制定。本研究利用Pull Down和免疫沉淀结合shot gun质谱鉴定方法对CSFV结构蛋白和非结构蛋白互作的宿主蛋白进行了鉴定，通过宿主蛋白的上调或下调表达分析了病毒蛋白与宿主蛋白互作在病毒复制中的作用。除了NS5A互作的热休克蛋白27（HSP27）负调控CSFV复制外，E2蛋白互作的膜联蛋白Annexin 2（Anx 2）、NS5A互作的真核翻译起始因子3（eIF3E）、NS4B互作的脂肪酸合成酶（FASN）和NS4A互作的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）都能促进病毒复制和子代病毒粒子的增殖，病毒感染诱导G6PD上调表达，下调G6PD表达诱导干扰素合成，进而抑制病毒的增殖。此外，脂筏扰乱试剂甲基-β-环糊精（M-β-CD）显著抑制CSFV的入侵和复制；系统发育分析将来自我国广东、广西和湖南等省市的CSFV流行毒株与GenBank发布的2.1亚型代表毒株分为10个亚亚型（2.1a-2.1j），其中2.1b和2.1c亚亚型占据优势地位，体外细胞适应性传代获得了高滴度的2.1b和2.1c病毒；NS5A是病毒复制和翻译的重要蛋白，不同毒株NS5A蛋白的切割方式不同，强毒Shimen株NS5A能产生截断蛋白b，弱毒疫苗C-strain NS5A切割产生截断蛋白b和c。研究发现caspase-6介导的C-strain NS5A截断蛋白c的产生是病毒复制所必须的，氨基酸替换发现NS5A蛋白的caspase-6结合基序和关键切割氨基酸位点分别为272DTTD275和A277；Erns蛋白具有诱导淋巴细胞凋亡和抑制干扰素合成等多种活性，信号肽能促进Erns蛋白的胞内表达，并引导Erns蛋白至内质网进行N-糖基化加工，调控过度糖基化的Erns蛋白分泌至胞外，同时251LLAW252是信号肽调节Erns蛋白加工的关键氨基酸序列。此外，实验利用逆转录病毒分别转导人端粒酶催化亚基（hTERT）基因或SV40大T抗原（SV40 LT）基因进入猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC），建立了永生化猪血管内皮细胞系SUVEC-hT和SUVEC-ST。上述研究成果为深入阐释CSFV感染和致病机制奠定了坚实基础。

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