AAV9病毒载体介导的GNE基因shRNA小鼠模型在DMRV疾病研究中的作用及其相关机制分析

Distal myopathy with rimmed vacuoles （DMRV）is a rare inherited autosomal recessive neuromuscular disease. The GNE gene is a target gene in the pathogenesis of DMRV. Because of its genetic defectiveness, and hence leading to the embryonic lethality in gene knockout mice, there have been no specific GNE-shRNA sequences in animal model, and the efficiency and mechanism of the target gene silencing is still unclear. In the first phase of the study, both of AAV8/9 transfected SOD1-shRNA mice model were successfully developed, and the tissues specific AAV9 was selected, showing high transfection efficiency in AAV9. In this stud, GNE-shRNA is transfected via AAV9 into Skeletal muscle tissues of neonatal ICR mice. Modeling efficiency and target gene inhibition rate are detected both in vitro and vivo. Additionally, RNA and protein expression levels of target gene in different tissues are analyzed, subsequently possible mechanisms of fatal liver toxicity and distinct gene transfer efficiency are explored. The result will provide safe and effective GNE-shRNA model for deepening research in DMRV, thus offering new concept in the field of genetic disease animal model establish a mechanism research in specific gene type.

有镶边空泡远端肌病（DMRV）是罕见的神经肌肉功能障碍染色体隐性遗传病，GNE基因是DMRV发病重要靶基因。因该病存在酶缺陷，基因敲除小鼠胚胎致死现象明显，故目前尚无GNE基因shRNA特异性动物模型，且不同组织靶基因抑制率及机制尚不明确。课题组前期使用AAV8、9载体将SOD1-shRNA导入小鼠体内成功获得RNAi动物模型，并发现AAV9具有高转染率。本项目拟在前期研究基础上选择新生ICR小鼠，通过AAV9载体转染将GNE-shRNA导入骨骼肌等组织，建立小鼠shRNA序列的RNAi转染模型，在体外细胞及体内动物实验水平验证建模有效率及靶基因抑制率，检测转染片段在不同组织中RNA及蛋白表达水平，分析产生致命性肝毒性及组织间基因导入效率差异机制。研究成果不仅为DMRV系统研究中构建有效安全GNE-shRNA模型奠定理论基础，并为特定基因的遗传疾病动物模型构建及机制研究提供新思路。

有镶边空泡远端肌病（DMRV）是罕见的神经肌肉功能障碍染色体隐性遗传病，GNE基因是DMRV发病重要靶基因。因该病存在酶缺陷，基因敲除小鼠胚胎致死现象明显，故目前尚无携带小鼠GNE基因的shRNA特异性动物模型，且不同组织靶基因抑制率及机制尚不明确。本课题围绕制造DMRV针对GNE-shRNA的重组AAV9载体，并深入研究产生致命性肝毒性及骨骼肌间基因导入效率不同的机制这一科学问题。设计了适用于小鼠GNE靶基因RNA干扰效应的序列，制造了GNE-shRNA特异性的重组AAV9载体，将其导入新生ICR小鼠体内，在避免发生全身毒性副作用的条件下，在骨骼肌中长期、最大限度抑制了靶基因，制作DMRV疾病RNA干扰效应的小鼠模型。实验过程中对参与课题研究人员进行细胞培养及分子生物学实验的基本培训。设计小鼠特异性GNE-shRNA序列，GNE-shRNA质粒构建，挑选靶基因抑制效率最强的基因序列。进行针对GNE-shRNA AAV9载体、构建、包装、纯化、及滴度测定。将GNE-shRNA AAV9载体导入细胞内，在细胞水平测定靶基因抑制效率。将AAV9 GNE-shRNA载体导入新生小鼠体内（腹腔注射），建立小鼠远端骨骼肌GNE基因缺失模型。测定骨骼肌中GNE-shRNA的抑制效率，验证GNE基因缺失对小鼠骨骼肌发育及功能产生抑制作用。因新生小鼠死亡，标本量缺失导致实验进度较慢不能按原标书计划完成，各组织中GNE-shRNA的抑制效率测定及shRNA肝毒性等副作用评估目前仍在进行中。研究成果不仅为DMRV系统研究中构建有效安全GNE-shRNA模型奠定理论基础，并为特定基因的遗传疾病动物模型构建及机制研究提供新思路。

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