鸡巨噬细胞系HD11分泌的外泌体（exosome）对适应性免疫应答的作用

Human or murine antigen presenting cell (APC) derived exosomes can activate adaptive immune response，possibly via direct or cross presenting antigen. Thus, antigen-loaded exosome generated by APC can be a vaccine candidate. However, the role of antigen loaded chicken APC derived exosomes on adaptive immunity is still unknown. Antigen-containing exosomes can be obtained from the cells expressing VSV G protein linked antigen. Thus, to elucidate the function of chicken APC derived exosomes for further development of chicken exosomal vaccines, the project employs lentivirus expression system to engineer chicken HD11 cells expressing IBV S protein fused with VSV G. The HD11 derived exosomes containing S protein are obtained from the engineered HD11. First, uptake experiment is used to analysis whether the HD11 derived exosomes can be absorbed by HD11 or myeloid dendritic cells (MDC). Meanwhile, the role of engineered exosomes on activating APC is compared to that of LPS treatment. Then, immunogenicity of the HD11 derived exosomes containing S protein are assessed. SPF chicken at 7 day-old are immunized with the engineered exosomes via intramuscular injection, of which blood samples are collected to estimate the titer of neutralizing antibody and the numbers of peripheral CD4+ or CD8+ T cells. Single cells from the chicken spleen are isolated and assessed the Ag-specific proliferative response. In summary, the study is designed to analysis the function of macrophage derived antigen-containing exosomes on adaptive immune response.

人或鼠源抗原递呈细胞（Antigen presenting cell，APC) 的外泌体具有抗原递呈作用，携带抗原后可激活适应性免疫应答。因此，APC外泌体可作为抗原的载体以增强其免疫原性。尚未明确鸡APC的外泌体也具有相同的功能。本项目以鸡巨噬细胞系HD11为研究对象，分析携带抗原的HD11外泌体在适应性免疫应答中的功能，为禽病外泌体疫苗的研发提供基础。将VSV G蛋白与抗原融合表达后，可把抗原携带至外泌体中以构建装载特定抗原的外泌体。因此，本研究应用慢病毒表达系统，在HD11中稳定表达G蛋白与鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S蛋白的融合蛋白，获得携带S抗原的HD11外泌体。首先，通过检测这种外泌体能否被APC摄取、诱导APC的活化以分析其抗原递呈功能。然后，将该外泌体接种雏鸡，通过中和抗体效价检测、T淋巴细胞亚群分析等方法，进一步分析其能否激活适应性免疫应答。

抗原递呈细胞（Antigen presenting cell，APC) 分泌的外泌体可通过存在其膜表面的抗原肽-MHC分子复合物直接激活与调控适应性免疫应答，也可在携带抗原的条件下被其他APC捕获而产生交叉抗原递呈。尚未明确鸡APC的外泌体也具有相同的功能。本项目旨在阐明携带抗原的HD11外泌体对适应性免疫应答的影响，为后期家禽外泌体疫苗研发奠定基础。已有研究报道VSV病毒G蛋白跨膜域与抗原融合表达后，可提高抗原载入外泌体的效率。因此，本项目应用慢病毒载体系统构建两株重组HD11细胞系，分别表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白，以及表达G蛋白跨膜域与鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S1蛋白的融合蛋白S1VSV。大批量培养重组HD11后，利用超速离心法从细胞培养物上清中纯化制备外泌体。经过透射电镜观察、NTA粒径分析以及Western Blot鉴定等方法确定成功制备携带外源蛋白的外泌体S1WT-exo，S1VSV-exo。将PKH67标记的重组外泌体，分别与HD11细胞、鸡骨髓源树突状细胞共孵育后观察到两种外泌体均被能抗原递呈细胞有效摄取。其中，S1WT-exo和S1VSV-exo与HD11共孵育后，引起IL-10的高表达和IL-12低表达，进而诱导HD11向M2型极化。与之相反，S1VSV-exo刺激树突状细胞后显著上调IL-12、BLA和免疫共刺激分子CD40的表达，有效促进树突状细胞分化与成熟。尽管S1WT-exo也可诱导树突状细胞中IL-12的表达上调，但未显著引起MHC分子以及CD40的表达上调。进一步将重组外泌体通过肌肉注射方式接种7日龄雏鸡，间隔14天后进行二次免疫。二免后第14天检测抗体产生水平和T淋巴细胞亚群分布。结果表明，重组HD11源外泌体可通过肌肉注射的免疫途径激活体内产生适应性免疫应答，但免疫应答水平存在显著的个体差异。本研究证实携带抗原的鸡巨噬细胞HD11源外泌体S1WT-exo，S1VSV-exo均具有免疫原性，参与抗原递呈与激活适应性免疫应答，但需要进一步研究引起二者调控树突状细胞分化与成熟能力差异的机制。

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