金银花活性成分对烟曲霉菌生物膜干预作用及其机制的体外研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
81260002
项目类别：
地区科学基金项目
资助金额：
50.0万
负责人：
陈一强
依托单位：
广西医科大学
学科分类：
H0102.呼吸系统感染、炎症与免疫
结题年份：
2016
批准年份：
2012
项目状态：
已结题
起止时间：
2013-01-01 至2016-12-31

项目参与者：
孔晋亮；王可；闫萍；朱莲娜；温汉春；伍巧源；蔡双启；杜仲业；
关键词：
烟曲菌耐药绿原酸异绿原酸生物膜

项目摘要

Aspergillus fumigatus (A.f) is the common pathogen which can cause pulmonary infections. The infection have refractory and drug resistance characteristics, which are closely related to fungal biofilm formation. The A.f biofilm formation and drug resistance have relation with hydrophobins, gliotoxin and drug efflux pump. Chlorogenic acid and its analogues are capable of exhibiting antifungal activities against some pathogenic fungi. We are screening the A.f strains that can form biofilm from the common clinical strains. We will choose honeysuckle flower active ingredients（chlorogenic acid,isochlorogenic acid）to interfere A.f biofilm under two in vitro conditions:(1) static,and (2)continous flow conditions. Biofilm semi-quantitative,crystal violet, confocal laser microscopy, XTT-reduction assay and viable bacterial counts are used to observe the inhibit and destruct effects of the drugs on A.f biofilm, and the coordinate sterilize effect of the drugs with other antibiotics. The antifungal susceptibility of biofilm to the drugs is evaluated by antifungal susceptibility. To determine whether the antifungal activity of chlorogenic acid and/or isochlorogenic acid is dependent on the metabolic activity.of fungal cells, killing assays are performed in the presence of NaN3. We will use RT-PCR detection method, HPLC-DAD to detect the products of gliotoxin, hydrophobins related genes and drug efflux pump genes,and then investigate the interfere mechanism of honeysuckle flower active ingredients on A.f biofilm from the molecular and genetic level.

曲霉菌是引起肺部真菌感染的常见病原体，具有难治性和耐药性的特点，与生物膜的形成有密切关系。曲霉生物膜的形成和耐药机制与疏水蛋白，胶霉毒素和药物外排泵有关。研究还发现绿原酸及其衍生物具有抗真菌作用。在前期筛选可形成生物膜的烟曲霉菌株的工作基础上，本研究组分别设计体外静止和流体生物膜模型，选用金银花性成分（绿原酸、异绿原酸）干预烟曲霉生物膜。采用生物膜半定量法，结晶紫染色法、XTT减低法、共聚焦显微镜等方法，观察药物对烟曲霉生物膜的抑制和破坏作用,及与其它抗真菌药的协同杀菌作用；采用抗真菌药物敏感试验评价生物膜对金银花活性成分联合抗真菌药的敏感性；采用加入叠氮化钠方法检测药物对生物膜是否为能量依赖性干预；采用RT-PCR、高效液相色谱-二极管阵列检测器等技术检测胶霉毒素含量,疏水蛋白基因和药物外排泵基因及唑类药物靶酶基因的表达；从而在分子和基因水平上，探讨金银花活性干预作用的机制。

结项摘要

烟曲霉菌是一种常见的条件致病真菌，能引起人全身多个器官多种类型的感染性疾病。对于免疫低下患者而言，烟曲霉感染往往是致命的。目前的调查研究显示烟曲霉的耐药率在逐渐上升，并且已经出现多重耐药菌株。耐药菌株的出现和流行对烟曲霉感染相关疾病的治疗造成很大的影响，因此近年来烟曲霉的耐药机制研究成为各国研究学者关注的热点。体内外的研究表明，烟曲霉能在多种载体上形成典型的生物膜结构，并且具有犹如细菌生物膜相似的耐药特点，成为烟曲霉耐药的重要机制。尽管目前对烟曲霉生物膜的研究已经取得一定进展，但是仍然没有研发出能抑制或者破坏烟曲霉生物膜的药物或者方法。本课题组从烟曲霉菌株的收集、鉴定、药敏试验、受试菌株菌株的确定及体外烟曲霉生物膜静止模型的建立开始进行研究。发现金银花活性成分（绿原酸和异绿原酸）能抑制和破坏体外静止模型培养下的烟曲霉生物膜，并因此能协同伏立康唑等抗真菌药物杀灭生物膜状态的烟曲霉菌。成功建立流动状态下的烟曲霉生物膜模型，并与静止模型的烟曲霉生物膜生长情况进行对比，发现静止模型更有利于烟曲霉生物膜形成以及金银花活性成分对流动模型培养的烟曲霉生物膜亦具有破坏作用。从基因水平发现金银花活性成分能抑制烟曲霉生物膜相关基因：疏水蛋白基因、药物外排泵基因、唑类耐药靶酶基因。从分子水平发现金银花活性成分对烟曲霉生物被膜形成的相关毒力因子-胶霉毒素的干预作用。对收集到的烟曲霉临床分离菌株进行RAPD分子流行病学分型，比较菌株的同源性及不同基因型生物被膜形成能力的差异。