抑制Rho/ROCK调控p27逆转乳腺癌CDK4/6抑制剂耐药的机制研究

The emerging drug cdk4/6 inhibitor is very effective in patients with advanced ER+ breast cancer, but its subsequent resistance is very intractable and the mechanism is still unclear. In our previous experiments, we found abnormal activation of the Rho/ROCK pathway and a decrease of p27 and a significant increase in CDK6 after drug resistance of the cdk4/6 inhibitor. Literature review suggested that ROCK could participate in the regulation of the cdk4/6 pathway, but its key molecular connections were not clear yet. We speculated that the Rho/ROCK pathway may induce cell resistance by regulating p27 and CDK6, therefore ROCK inhibitor may be an effective way to relieve cdk4/6 inhibitor resistance. This study used clinical pathology, in vitro cancer cell culture method and the nude mice model, through CRISPR gene knockdown, CO - IP, phosphorylation mutant plasmid construction, RNA seq and phosphorylation antibody chips, from the aspect of histology, cytology, molecular biology, to reveal the regulating mechanism of Rho/ROCK to CDK4/6 pathways, discusses the possibility of using ROCK inhibitors, which provides theoretical support and new ideas for the treatment of breast cancer after cdk4/6 inhibitor resistance.

新兴药物CDK4/6抑制剂对ER+晚期乳腺癌患者疗效颇佳，但其后续耐药非常棘手，且其机制尚不明确。我们前期研究发现乳腺癌CDK4/6抑制剂耐药后Rho/ROCK通路异常激活、p27下降、CDK6明显上升，文献回顾提示ROCK可参与CDK4/6通路调控，但其关键分子联络尚不完善。我们推测Rho/ROCK通路可能通过调控p27影响CDK6诱发细胞耐药，因此ROCK抑制剂可能是解救CDK4/6抑制剂耐药的有效途径。本研究拟采用临床病理、体外癌细胞培养及裸鼠荷瘤模型等手段，通过CRISPR基因敲除、CO-IP、磷酸化突变体构建、RNA seq及磷酸化抗体芯片等方法，从组织学、细胞学、分子生物学层面，揭示Rho/ROCK通路对CDK4/6通路的调控机制，探讨ROCK抑制剂逆转耐药的可能，为乳腺癌CDK4/6抑制剂耐药后治疗提供理论支持和新的思路。

新兴药物CDK4/6抑制剂对ER+晚期乳腺癌患者疗效颇佳，但其后续耐药非常棘手，且其机制尚不明确。本研究从组织学、细胞学、分子生物学层面，揭示Rho/ROCK通路对CDK4/6通路的调控机制。本研究首先通过临床收集CDK4/6抑制剂耐药前后乳腺癌标本进行PCR及免疫组化检测，发现耐药后的组织标本中RhoC及CDK6明显上升，p27表达下降。进一步生信分析发现RhoC高表达与乳腺癌不良预后相关。其次，通过在耐药细胞中下调RhoC或使用ROCK抑制剂可以使耐药细胞恢复对CDK4/6抑制剂敏感性，降低细胞干性成球能力以及侵袭转移能力。而在亲本细胞中上调RhoC可以诱导细胞耐药，增加细胞干性成球能力及侵袭转移呢能力。这主要通过RhoC异常激活调控p27影响CDK6表达所致。ROCK可部分参与p27的C末端的磷酸化及CDK2 激活。同时研究发现在耐药细胞构建裸鼠皮下移植瘤及尾静脉转移瘤中联合使用ROCK抑制剂或者靶向敲除RhoC可以逆转耐药，降低细胞干性及侵袭转移能力，为乳腺癌CDK4/6抑制剂耐药后治疗提供理论支持和新的思路。.同时本课题组在研究过程中也有一些意外的发现，进行的新的探索。结合生信研究发现p21可通过调控p53诱导细胞衰老过程从而调控对CDK4/6抑制剂耐药。同时我们还发现乳腺癌耐药细胞中虽然有细胞衰老现象，但细胞仍然可以持续增殖，这可能与p21浆细胞定位相关。该部分内容仍需进一步深入。.虽然主体研究尚未投稿，但目前依托本课题资助，已发表SCI文章1篇（JECCR）。目前仍有受本课题资助而进行研究的1篇 CI论文在投稿中，投稿文章中均明确注明受到本研究课题项目资助。

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