褐煤生物液化高效复合菌群的构建及其协同机理研究

Bioliquefaction of lignite not only overcomes shortcomings on conditional utilization such as environmental pollution and harsh reaction conditions, but also breaks a new path on comprehensive utilization of lignite, which becomes one of the hot points on coal clean utilization in resent thirty years. However, complicated lignite structure causes hard to be liquefacted by single strain, resulting in low liquefaction ratio. Accordingly, this project focuses on enhance liquefaction ratio by synergistic effect in different strains in constructed multiple strains. Firstly, microorganism’s community composition in lignite mining area around Guizhou province and that in liquefaction system will be analysed by modern molecular biology ways, that is, total DNA of genome will be extracted and PCR amplification of bacteria, actinomyces and fungi by different primer, and then electrophoresis, cloning and phylogenetic tree construction. Subsequently, liquefaction functional strains and helper strains will be screened out, and then multiple strains will be constructed artificially strains double crossing method. At the end, lignite synergistic effect mechanism will be explained by comparison enzymes’ activities, biologic alkaline substances in single strains and multiple strains, which provides guidance on coal liquefaction application.

褐煤的微生物液化既可以克服传统利用中污染大、反应条件苛刻等缺点，又可以为褐煤的综合利用开发一条新的途径，是近几十年煤炭洁净利用领域的研究热点。然而，褐煤结构复杂，很难被单一菌株有效液化，所以液化效率低，限制其工业应用。本项目拟构建褐煤液化复合菌群并通过不同菌种间的协同作用来提高液化效率。首先，以贵州周边褐煤矿区环境和褐煤液化体系为研究对象，提取基因组总DNA后，通过不同引物分别对细菌、放线菌和真菌进行PCR扩增，随后电泳、回收特异性条带、导入载体克隆后构建系统发育树，鉴定出液化微生物，从而探索液化体系的微生物群落组成。其次，从中分离纯化出各种液化功能菌及辅助菌，通过菌种复配进行人工构建复合菌群，并对其煤液化特性进行优化。最后通过比较研究单一/复合微生物液化褐煤过程中酶活性、生物碱等变化来阐明复合菌群对褐煤协同液化机理，为煤炭的生物液化应用提供理论指导。

褐煤微生物液化是一种环境友好的煤炭加工方法。然而，液化效率低影响了其工业应用前景，为此，本项目从混合培养角度来强化液化效果。.研究结果：① 通过对昭通褐煤矿区土壤微生物多样性分析发现，矿区土壤中的细菌大部分属于厚壁菌门，占91.3%，其次是变形菌门，占7.68%；真菌中子囊菌门丰度最大，占81.21%，担子菌门次之，为16.17%。通过从褐煤堆放山6个采样点的4个不同深度土壤采样并分别进行真菌和细菌筛选、纯化，共获得144株真菌、11株细菌。通过对褐煤的液化试验发现，具有明显液化能力的真菌有13种。② 通过对裂褶菌、云芝菌及其混合菌的比较，发现在相同的时间内，混合菌与单一菌相比较具有优势互补的，混合菌总比单一菌长得好。加煤液化13天后，液化产物的在450nm处吸光度分别为0.57、0.55、0.65，说明混合菌对煤炭的液化能力更强。酶活测定发现，混合菌种的LiP酶活性均有提高，最高可达91.9倍，证明混合培养有正协同作用。③ 利用高通量测序技术对单一菌种、复合菌种在液化模式下菌群组成分析，根据Shannon多样性分析、Venn图、Heatmap图、Circos图、Sunburst图、层级聚类树图、三维PCA图、进化树关系等多角度分析发现，混合培养后共有菌种数为380个，其中353个为独有菌种，优势菌种为Hypocreaceae和Pleosporaceae。④ 在复合菌种构建中发现，10中混合菌组合中，有4种组合的白腐真菌产LiP有明显的协同作用，其活性是单一菌种的1.5~6.7倍。其中，T.versicolor和ZTW07组合酶活最大，在液化第9天，LiP活性就达170.00 U/L，而单独培养仅为25.22和56.80 U/L。真菌ZTW07和SL203混合三种酶分泌的综合效应最大，Lac、MnP和LiP的协同效应系数分别为158.795, 1.217, 和1.006。⑤ 褐煤液化效果（A450nm）和LiP活性具有较好的线性关系，R2为0.9779，从而证明木质素过氧化物酶在褐煤液化中起到关键作用。通过13C NMR分析发现，液化前褐煤的芳碳率fa为0.565，液化后获得的产物的芳碳率为0.544，证明褐煤在LiP催化下发生了开环反应。此外，酚或芳醚碳（faP）和与氧连接的脂肪碳（falO）的相对含量有分别增加了0.87%和0.38%，说明发生了一定氧化反应。

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