高压电晕电场对蒺藜苜蓿的诱变机制研究

High voltage corona electric field(HVCEF) is a new mutagenic technique. This technique causes a higher mutation rate with lower damage and environmental friendly. However the mutagenic mechanisms of HVCEF remain unclear and have no more experimental validation. We conclude that non-uniform electric field and low temperature plasma may be synergic on the mutagenic effect of HVCEF. In this study, we will measure species composition, spatial distribution, particle density of low temperature plasma produced by HVCEF under different parameters. Then, Medicago truncatula will be used as mutagenic materials. And the quantitative of reactive oxygen species (ROS) and DNA strand break after HVCEF treated will be measured. Stable mutants induced by HVCEF will be selected and confirmed. Then resequencing the whole genome of the stable mutants, and mutational sites include single nucleotide polymorphism (SNP), base pair nsertions/deletions (Indel) and structural variation (SV) of the whole genome will be detected, gene ontology and positional cloning of mutant gene. Thus reveals the laws of relationship between different HVCEF parameters , different plasma parameters, reactive oxygen species (ROS) and DNA strand break levels, genome variation. It provides theoretical and experimental basis to understand the mutagenic mechanism of HVCEF, and it also provides the experimental foundation for biological mutation breeding of legume crops or grassesl and the extensive application of HVCEF.

高压电晕电场是近年来发现的有很多优点的新型物理诱变剂。然而其诱变机制还缺少必要的实验积累且没有准确的定论。本申请认为高压电晕电场的诱变效应是由非均匀电场和低温等离子体协同作用产生的。本项目对不同参数的电晕电场所产生低温等离子体进行诊断，在此基础上以蒺藜苜蓿为诱变材料，检测电晕电场处理后活性氧（ROS）水平及DNA链断裂情况，筛选出电晕电场诱变的稳定突变株，基因组重测序后，统计基因组中单核苷多态性（SNP），多碱基插入缺失（Indel）和结构变异（SV）情况， 对变异位点进行GO注释，相关基因图位克隆，分析基因组基因变异特点。从而揭示不同电晕电场参数、不同等离子体参数、活性氧（ROS）及DNA链断裂水平、全基因组基因变异四者之间的关系和规律，为全面揭示高压电晕电场的诱变机制提供实验和理论依据， 为高压电晕电场在豆科农作物、牧草以及其他物种的诱变育种及其它领域的更广泛应用提供实践指导和线索。

本项目首先全面、系统地研究了高压电晕电场对苜蓿生物效应，分析了高压电晕电场中非均匀电场和电晕放电等离子体这两种主要因素对苜蓿种子的影响，对经电晕放电场处理前后的苜蓿种皮表观接触角进行检测，通过扫描电子显微镜观察处理后种皮微观形貌的变化情况，运用傅里叶变换红外光谱技术对不同处理苜蓿种皮的光谱图进行对比检测，确定电晕放电所产生的低温等离子体对高压电晕电场诱变效应的贡献率。检测了不同参数（针-板距离、电压、时间）高压电晕电场处理去离子水，所得到的活化水中长寿命粒子浓度，对活化水紫外光谱进行检测分析，并用等离子体活化水诱变蒺藜苜蓿种子，检测等离子体活化水和等离子体联合处理后蒺藜苜蓿幼苗全基因组表达差异情况。同时作为拓展，研究了高压电晕电场作用对沙冬青、裸燕麦的生物效应，分析了等离子体活化水及等离子体对沙打旺基因表达影响。.本项目的重要研究结果包括：（1）在高压电晕电场处理中，离子风比非均匀电场对种皮亲水性影响大。随着电压的升高，苜蓿种皮刻蚀严重，种子表皮纤维素降解和种皮表面裂缝产生的增加导致了其吸水能力的提高，进一步导致了苗高等生长特性的改善。并且在轻度至中度刺激下，植物体内产生了应激反应，酶活性增强，渗透调节能力增强，新细胞加速促进植物生长，高压电晕电场处理产生的影响已转化为宏观的生物效应。（2）单纯的高压电晕电场可对苜蓿种子产生刺激效应，增加种子亲水性，促进种子快速萌发，但由于对种子的存活率影响不大，达不到诱变育种的要求。（3）高压电晕电场下对等离子体活化水活化效率高，制备的等离子体活化水浓度高，且随着处理时间延长，总浓度呈上升趋势。（4）高压电晕电场和等离子体活化水联合处理蒺藜苜蓿种子，种子存活率低于半致死剂量，可以用于诱变育种的研究。联合处理会引起大量基因表达上调，促进植物代谢，PAW组大量具有解毒和抗氧化活性功能的基因表达上调，使植物对等离子体活化水刺激作出的反应，更易在极端环境下存活。本研究为高压电晕电场生物技术拓展研究领域提供了思路和实验证据，为等离子体活化水诱变育种机制研究提供实验数据支持。

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