红平红球菌摄取二苯并噻吩的机制及调控研究

微生物能够在温和条件下，脱除石油中加氢脱硫难以处理的二苯并噻吩（DBT）类化合物，具有广阔的应用前景。迄今提高微生物脱硫活性的研究集中在脱硫基因的高效表达，对于微生物摄取DBT的机制关注甚少。本项目以红平红球菌R. erythropolis LSSE8-1为对象，研究细胞摄取DBT的机制，（1）利用生物信息学分析，插入失活、互补实验和TAIL-PCR等方法，克隆DBT结合蛋白和跨膜运输蛋白基因簇，研究基因簇结构和表达调控；（2）利用重组质粒提高DBT转运相关蛋白表达量，分离和验证其功能，研究其表达量与细胞脱硫活性之间的关系；（3）分析、比较高/低脱硫活性红平红球菌细胞壁组成的差异，揭示细胞壁对DBT摄取效率的影响。本研究将阐明红球菌摄取DBT的机制，建立调控细胞摄取DBT速率、提高微生物脱硫活性的方法，将为设计高活性代谢菌株提供新的研究思路，具有重要的理论研究和实际应用意义。

生物脱硫技术具有选择性高、反应条件温和、设备简单、运行费用低、对燃料热值影响小等优点，是降低石油产品硫含量的有效途径。针对本实验室分离的专一性脱硫微生物Rhodococcus erythropolis LSSE8-1，研究了其摄取DBT过程对脱硫活性的影响，通过强化其摄取过程提高了脱硫活性。考察了R. erythropolis LSSE8-1摄取CxDBT效率对脱硫活性的影响，结果表明：脱硫酶对DBT、4, 6-DMDBT没有选择性，CxDBT跨膜传递严重影响脱硫活性。LSSE8-1细胞裂解液上清在添加10 mM NADHNa2和20 μM FMN时达到最大脱硫活性。在前3小时内，上清脱硫速率明显高于细胞裂解液和静息细胞。传质助剂Tween80可以显著提高LSSE8-1静息细胞脱硫活性。通过在LSSE8-1静息细胞及细胞裂解液中添加电子传递抑制剂NaN3，证实DBT跨膜传递过程为主动运输过程。通过在CxDBT跨膜传递蛋白基因（HcuABC）保守区设计引物扩增其部分片段，证实其在Pseudomonas delafieldii R-8中存在。然后扩增了R-8的HcuABC全基因序列，对比研究发现其与P. aeruginosa NCIMB9571、LESB58、PA01、UCBPP-PA14高度同源，显示了在进化关系上的相关性。其高度同源序列为ABC膜通道蛋白。构建了DBT及其衍生物跨膜传递基因HcuABC表达载体pBSJ-HcuABC，并将其转入专一性脱硫菌R. erythropolis LSSE8-1中进行表达，脱硫活性明显提高。对于DBT脱硫率提高19%，对于4,6-DMDBT脱硫率提高13%。DBT及其衍生物跨膜传递过程对于微生物脱硫是一个重要影响因素。

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