中蜂囊状幼虫病毒培养体系建立及其受体与受体结合蛋白筛选

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31372435
项目类别：
面上项目
资助金额：
80.0万
负责人：
马鸣潇
依托单位：
锦州医科大学
学科分类：
C1803.兽医细菌及其他微生物学
结题年份：
2017
批准年份：
2013
项目状态：
已结题
起止时间：
2014-01-01 至2017-12-31

项目参与者：
李丽；栾治东；隋慧；费东亮；姜莉莉；韩喜彬；高慎阳；张皓淳；李勇飞；
关键词：
受体结合蛋白蛋白组中蜂囊状幼虫病毒受体

项目摘要

Chinese Scabrood Virus (CSBV) is the primary viral pathogens of bees, which, once in place, will bring the bee industry a devastating disaster, but now as there is no suitable cell for CSBV cultivation and CSBV invasion process is still not clear, new antiviral drugs design directing at the virus invasion process is seriously limited. By combining dimensional electrophoresis with mass spectrum, the proteome differences between CSBV-infected bee larva primary cell and the control cell in the successfully isolated bee larva primary cell, which could be stably fostered, were compared to postulate the cell changes after CSBV infection and the possible intracellular virus duplication requirements. Based on this foundation, the T7 phage surface display technology and GST-pull down technology were adopted to screen out the bee larva primary cell protein which combined with the purified structural protein VP1, VP2 and VP3. Meanwhile, the CSBV receptor in the bee larva primary cell was confirmed, RNAi technology, BIAcore (biomolecuar interaction analysis) and co-immunoprecipitation were applied to identify the receptor and illustrate the CSBV cell intrusion mechanism for further study on the CSBV nosogenesis and the design of specific anti-CSBV drug.

中蜂囊状幼虫病毒（CSBV）是当前危害中蜂的首要病毒性病原，一旦发生，就会给中蜂业带来毁灭性的灾害，但目前由于没有适合培养CSBV的细胞，对CSBV侵入宿主细胞的过程仍不清楚，严重限制了针对病毒入侵过程来设计新型抗病毒药物。本项目拟在已成功分离可稳定培养的中蜂幼虫原代细胞上，利用双向电泳结合质谱鉴定比较CSBV感染中蜂幼虫原代细胞与对照细胞的蛋白质组差异，观察CSBV感染细胞后引起的细胞变化，病毒在细胞内复制的条件。在此基础上，利用T7噬菌体表面展示技术和GST-pull down技术，筛选出与纯化的结构蛋白VP1、VP2、VP3相结合的中蜂幼虫原代细胞蛋白，确定CSBV在中蜂幼虫原代细胞上的受体和相应的结构蛋白，并应用RNAi技术、BIAcore 技术和免疫共沉淀技术对受体进行鉴定，阐明CSBV进入细胞的机制，为CSBV的致病机理研究和特异性抗CSBV药物设计奠定基础。

结项摘要

中蜂囊状幼虫病毒（CSBV）是当前危害中蜂业的首要病毒性病原，一旦发生，就会给中蜂业带来毁灭性的灾害，但目前由于没有适合的CSBV培养体系，严重限制了针对病毒入侵过程来设计新型抗病毒药物。本研究成功建立了CSBV细胞培养体系和2-3D中华蜜蜂幼虫培养体系，分别对细胞培养体系的细胞形态特点、生长情况，幼虫培养体系接种CSBV后临诊特征、病毒和宿主的SiRNA变化等方面进行了研究，标准化培养体系。研究表明CSBV可以在这两个体系中进行增殖，引起幼虫原代细胞快速分裂、接种CSBV的幼虫不能正常化蛹，出现病变。利用幼虫培养体系对我国CSBV主要流行基因型代表毒株的进行培养，纯化及其分子生物学特性、理化特性、交叉免疫原性，致病性等进行研究，筛选优势毒株。在此基础上，利用酵母双杂交系统，构建中华蜜蜂幼虫培养体系cDNA文库，分别以CSBV结构蛋白基因VP1、VP2和VP3构建诱饵质粒与文库进行筛选，获得与病毒复制和免疫相关的互作的蛋白有昆虫半乳凝素1（Galectin1)、40S、60s核糖体蛋白、中华蜜蜂易位链相关膜蛋白、中华蜜蜂热休克蛋白70KDa、NPC2，并通过GST-pull down和Co-IP技术，对筛选得到的主要蛋白进行鉴定。在开展本研究过程中，密切联系生产实际，对影响我国养蜂业的主要蜂病毒CSBV、DWV和CBPV进行实时监测和研究，首次发现了发现CSBV能够突破种间障碍，直接感染意大利蜜蜂并造成大量死亡，同时进行了CSBV防治技术研发，相关研究获得辽宁省科技进步二等奖。