ECP1在弓形虫微孔内吞摄入营养中的作用机理

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite, suggesting it must acquire nutrients from host cells. Host organelles invaginate on the parasitophorous vacuolar membrane, releasing vesicles in the vacuole which serve as a nutrient source for parasites. How these vesicles are up-taken into parasites is controversial. Recent advances that the Vacuolar Compartment (VAC) was identified as a parasite endo-lysosome and host proteins were ingested and digested in the VAC strongly argue for existence of endocytosis in T.gondii, potentially at the micropore. However, its mechanism is completely unknown. The applicant has discovered a novel EH-domain Containing Protein named ECP1, which is essential for parasite growth and localized at the micropore. EH domain proteins are associated with endocytosis by mediating protein-protein interactions and by acting as a dynamin-like protein. Therefore, the applicant strongly proposes, (1) to dissect the function of ECP1 on nutrient acquisition via endocytosis at the micropore; (2) to identify the protein-protein interactome mediated by ECP1, and the interactome’s role on endocytosis using various modern technologies such as co-immuno-precipitation, biotinylation, mass-spectrometry and bioinformatics, aiming to find out the molecular basis and mechanism of endocytosis via the micropore; (3) to further confirm the significance of endocytosis at the micropore on nutrient acquisition in chronic toxoplasmosis. This study will potentially provide drug targets and vaccine candidates against toxoplasmosis, and it will also lay solid foundation for studies on nutrient acquisitioon for other Apicomplexan parasites.

弓形虫是细胞内专性寄生虫，须从宿主获取营养。宿主细胞器在寄生虫囊泡膜内陷形成小泡而成为虫体的营养来源，然而这些小泡如何摄入有较多争议。近年弓形虫内溶酶体和大分子被摄入虫体的发现，使微孔的内吞作用受到关注，但对其机理完全未知。申请人在前期研究发现一个含EH结构域的新蛋白质ECP1，定位于微孔，且是必需蛋白质。EH结构域蛋白质参与内吞作用，能起动力蛋白的作用，并介导蛋白质的相互作用，推测ECP1是微孔内吞作用的关键蛋白质。因此，申请人拟开展研究：1）明确ECP1在微孔内吞宿主营养中的功能；2）利用免疫共沉淀、生物素标记技术和软件分析等方法，解析ECP1介导的蛋白质互作网络，探明该网络的作用方式，以期揭示微孔内吞作用的分子基础和机理；3）探讨缓殖子微孔内吞作用及其在慢性弓形虫病中的意义。本研究顺利实施将对慢性弓形虫病的药物靶点和疫苗抗原的筛选有重要意义，对其他顶复门原虫的研究也有直接影响。

弓形虫是重要人兽共患原虫，同时也是一种顶复门原虫的模式生物。然而，弓形虫获取营养物质的分子机制的认识进展极其少，而内吞作用在真核生物中是一种重要的营养获取机制。本研究以经典内吞蛋白为起点，寻找潜在的蛋白分子。我们发现3个AP2相关亚基、以及EPS15蛋白，定位于质膜点状位置。以EPS15蛋白为出发点，采用生物素临近标记方法（EPS15-TurboID），发现了5个新蛋白。最后该研究发现了弓形虫内吞作用潜在蛋白10个。采用免疫胶体金技术，结合连续电镜切片，确定了Kelch13定位于微孔。为构建蛋白互作关系网了，我们再次采用生物素标记技术，明确了Kelch13, PPG1和EPS15作为互作关系的核心成员。在此基础上，采用生物生长素诱导降解技术，构建了10个关键蛋白敲低虫株，研究这些蛋白的功能。部分蛋白在敲低后确实会引起虫株生长缺陷，但是并不会引起虫体逸出和侵入宿主细胞障碍，但是虫体在胞外环境会极其不稳定。采用虫体摄入宿主细胞GFP的实验分析，发现，敲低核心蛋白Kelch13后，虫体无法有效摄入宿主细胞质GFP。因此，该研究首次在实验上发现和证实了弓形虫微孔进行内吞作用摄入宿主细胞质营养。进一步实验研究发现，微孔具有摄入宿主细胞生物素、以及宿主细胞高尔基体中神经酰胺的功能。为了进一步理解微孔对虫体在生长和代谢上的影响，我们分析了转录组和代谢组，研究发现关键蛋白敲低后会导致虫体在多种代谢途径的差异变化，更为清楚的是会引起虫体碳代谢特别是线粒体TCA循环出现障碍。这些组学结果表明弓形虫微孔关键蛋白可以通过调低线粒体代谢过程，而减低虫体的代谢过程。我们进一步分析了透射电镜和扫描电镜，透射电镜清楚地表明这些关键蛋白敲低会引起微孔结构变形或者消失，并在相应位置出现空洞。而扫描电镜从虫体的外围能更加清楚的看到，微孔蛋白缺失导致微孔缺失并出现结构性的空洞。此外，我们进一步进行小鼠毒力实验，虫体缺失Kelch13会引起小鼠毒力完全消除，支持Kelch13是微孔中最核心的蛋白。该研究成功破解了弓形虫通过微孔进行内吞作用的分子机制和意义。

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