ATP7B基因变异的致病性分析及其导致肝豆状核变性发病的分子机制研究

Wilson 's disease (WD) is an autosomal recessive genetic disorder of copper metabolism. The ATP7B mutation could affect and damage the live, brain, kidney and other organs due to copper deposition. It is one of the few treatable inherited diseases, depending on early diagnosis and timely treatment. Therefore, how to quickly and accurately diagnose WD has been becoming the clinical focus. Although ATP7B mutation screening is the gold standard for WD diagnosis, genetic test results sometimes remain elusive during long-term clinical practice. When previously analyzing ATP7B gene, we found some genetic variants with uncertain significance and negative screening test among clinical diagnosed WD patients, ultimately hindering diagnosis. Based on the previous results and the construction of transiently transfected cells, stably transfected cell lines and Sf9 cells expression system, we aim to investigate the effect of single-base substitution variant with uncertain significance on ATP7B protein expression, cellular localization and copper transport, and the impact of splicing variant on mRNA transcription mode, thereby verifying the pathogenicity and its molecular mechanism. Furthermore, we analyze the frequency of large intragenic deletion or duplication within ATP7B of Chinese WD patients via MLPA technology, improve mutation map drawing and optimize genetic diagnosis strategy, to ensure early diagnose and proper treatment.

肝豆状核变性（WD）是常染色体隐性遗传性铜代谢病，ATP7B突变导致铜沉积于肝、脑、肾等组织器官而出现相应的临床症状。WD是少数可治的遗传病之一，关键在于早诊早治。因此，如何早期快速确诊是临床亟待解决的问题。尽管ATP7B突变筛查是确诊WD的金标准，然而长期临床实践表明，该基因检测结果有时难以判读。我们前期亦发现一些致病性质无法明确的基因变异，及部分临床确诊的WD患者未检出ATP7B变异，这些均妨碍患者的确诊。本项目拟在前期研究基础上，构建瞬转细胞系、稳转细胞系及Sf9细胞表达系统，探讨ATP7B基因致病性质未明的单碱基变异对蛋白表达、细胞定位和排铜活性的作用，及剪切位点变异对mRNA转录方式的影响，从而阐明各种变异导致WD发病的分子机制；并采用MLPA技术分析中国WD患者ATP7B大片段缺失或重复的频率，完善突变图谱绘制，优化基因诊断策略，为患者得到及时规范的诊治提供保障。

项目背景：.肝豆状核变性（WD）是常染色体隐性遗传性铜代谢病，具有复杂的临床和遗传异质性，不规范及延误治疗可导致患者预后极差，影响患者生活质量甚至生命。然而，WD是少数可治疗的遗传病之一，关键在于早诊早治，故凸显早期临床和基因诊断的重要性。.主要研究内容：.1，借助神经遗传专病门诊，诊疗WD患者，进一步扩大ATP7B基因变异库，筛查大片段缺失，提高基因诊断敏感性；.2，总结归纳WD患者的关键性诊断指标，包括血清铜蓝蛋白，24小时尿铜，头颅MRI，角膜KF环，重新界定临床诊断范围；.重要结果及关键数据：.1，在144个WD患者中，通过Sanger测序法我们共检出78种非同义变异，其中14种为新变异。根据美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）指南最终界定其中34个为致病变异，32个为可能致病变异，5个为未确定意义的变异，7个为良性变异。通过MLPA技术，我们在6个未明确基因诊断的WD患者检出3种新的大片段缺失变异；另外，在1个可疑纯合变异的WD患者中检出1种新的大片段缺失变异；最终，通过长片段PCR和直接测序法，明确其中3种大片段缺失的具体融合序列位置；.2，肝脏受累患者起病年龄（16.94±1.03; P= .0105）或骨肌受累（13±1.33岁; P= .0001）比神经受累患者（19.48±0.46岁）显著偏早。血清铜蓝蛋白水平为18.93到120.00 mg/L（分位数为0.025至0.975）。14岁以上和14岁以下的患者之间24小时尿铜水平存在显著差异。在355例神经受累WD患者中，244例（69％）的头颅MRI和KF环同时异常。只有1例MRI异常的患者角膜KF环阴性；.科学意义：.1，进一步扩展了ATP7B基因变异体的数据库；MLPA技术应作为Sanger测序法筛查ATP7B基因变异的方法补充，进一步提高WD患者基因诊断阳性率，从而优化患者的早期治疗；.2，发现血清铜蓝蛋白低于120mg/L高度提示WD患者；在≦14岁儿童患者中，24小时尿铜>40μg提示可疑WD，应行ATP7B基因筛查；患者若以运动障碍为主要临床表现和基底节区异常为主要影像学表现，但角膜K-F环为阴性，临床应谨慎诊断为WD。从而优化患者的早期治疗和预后。

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