氨基糖苷类修饰酶和底物分子识别机制的研究

)：针对酶修饰造成的日益严重的抗生素抗药性问题，采用理论和实验结合的方法，对氨基糖苷类修饰酶和抗生素等不同底物分子识别的序列和结构信息展开深入研究，从而揭示细菌耐药性的机制。首先通过序列、结构比对等生物信息方法，对不同种类的氨基糖苷类修饰酶进行序列和结构的比较，确定其家族在序列和结构上的保守模式。同时选取不同修饰酶的典型代表，通过荧光、紫外、ITC、EPR 以及活性测试等多种实验手段对酶和抗生素底物的识别机制以及催化过程进行分子、原子水平的研究，特别是辅因子引起的底物特异性，酶的构象变化以及活性中心重要位点的识别。通过对其热力学和动力学性质的分析比较，找出不同修饰酶失活抗生素药物的共同作用机理，从而为设计新的抗生素药物以及修饰酶抑制剂，克服细菌的耐药性提供理论指导和技术支持。

本项目针对抗生素抗药性日益严重的问题，重点从分子水平研究引起抗药性的氨基糖苷类修饰酶和底物分子的识别机制，旨在揭示不同修饰酶失活抗生素的共同作用机理，从而为设计新的抗生素药物以及酶活性抑制剂，克服细菌的耐药性提供理论指导和技术支持。.首先本项目选取氨基糖苷类磷酸修饰酶等作为典型代表，通过蛋白质的表达和纯化得到一系列具有生物活性的蛋白质，并对酶的活性和结构进行了一定的测试。接着针对修饰酶和药物分子识别过程中，修饰酶和抗生素小分子以及金属离子和ATP辅因子组成的复杂反应体系，通过荧光、紫外、ITC、EPR以及活性测试等多种方法研究了磷酸修饰酶等和不同配体识别的结合常数、化学计量数等热力学和动力学参数，从而发现了辅因子引起的底物特异性，酶的构象变化以及活性中心重要位点的识别。在此基础上，设计了修饰酶的嘌呤抑制剂，验证了5-nitroisoquinoline和3-amino-5-nitrobenzisothiazole在和修饰酶作用过程中，占据了酶的活性中心，具有较强的亲和力，同时可以抑制修饰酶的部分活性，是一个比较好的酶活性抑制剂。在此基础上我们对氨基糖苷类修饰酶及其复合物的结构和序列进行理论研究，发现和修饰酶活性中心残基发生作用的主要是氨基糖苷类抗生素的A, B两个环的官能团，A环和B环在酶的活性中心都表现为相似的构象。自由的修饰酶构象比较松散，一旦和抗生素结合，复合物的结构变得比较紧密，很好的解释了氨基糖苷类修饰酶底物的广谱性。同时氨基糖苷类修饰酶上存在大量的二硫键或者自由巯基，容易形成二聚体，影响酶的活性。因此我们通过修饰酶的自由巯基和定点突变，进行荧光标记，设计了修饰酶传感器，进行抗生素的检测。针对二硫键的重要性，我们还研究了二硫键在蛋白质中的结构和功能保守性，并设计了通过二硫键稳定的RGD活性分子。围绕着抗生素抗药性，我们还利用纳米孔等单分子技术对酶、蛋白质和药物分子等配体的相互作用以及跨膜运动展开研究，发现了蛋白质在跨膜过程中，存在解折叠现象，通过阻塞信号很好的表征了蛋白质的构象变化。

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