中国番茄黄曲叶病毒卫星编码的βV1蛋白诱导过敏性坏死的分子机制研究

Members of family Geminiviridae are plant DNA viruses that infect economically important crops and cause serious damages in agriculture worldwide. βV1 protein, encoded by satellite DNA β, functions as an important pathogenicity factor in geminiviruses infection. Previous study confirmed that βV1 protein could elicit hypersensitive response (HR)-type cell death in N. benthamiana leaves, yet its molecular basis remains elusive. In this study, we will further dissect this βV1-elicited-HR process. Firstly, we will identify key elements in this process by 1) screening potential βV1-interacting candidates through immunoprecipitation and mass spectrometry analysis; and 2) analyzing the involvement of potential candidates in βV1-elicited-HR by TRV-based RNA silencing assay. Based on that, we will further evaluate whether these identified key elements are involved in host defense by virus challenging assay. On the other hand, we will identify the essential domain(s) of βV1 in inducing HR-type cell death by generating a series of truncated protein, and demonstrate the connection of βV1-elicited-HR and its pathogenesis. Our results could help uncover the molecular basis of resistant signaling upon geminivirus infection, and provide theoretical basis for antiviral breeding.

双生病毒是一类对经济作物造成严重危害的植物DNA病毒,卫星DNAβ编码的βV1蛋白是负责双生病毒侵染的重要致病因子。前期工作证明βV1蛋白能够诱发本氏烟过敏性坏死，但具体的分子机理目前仍不清楚。本研究课题基于这一现象，将对这一过程的具体调控因子与信号通路作深入解析。本研究首先拟通过免疫沉淀-蛋白质谱的方式筛选βV1在本氏烟内潜在互作靶标蛋白，并结合基因沉默的方法鉴定出βV1诱导HR的关键基因。在此基础上，构建基因敲除本氏烟植株，利用病毒侵染实验进一步验证鉴定到的关键基因在抵抗病毒侵染中的作用。另一方面，对βV1蛋白本身也会通过截短实验确定该蛋白诱发HR的关键结构域，明确该蛋白诱发HR与致病性的关系。研究结果可为揭示植物在双生病毒侵染后抗性信号产生和传导的分子机制提供启示，也可为作物抗病毒育种提供理论依据。

双生病毒科病毒是全球范围内危害植物最严重的病原物之一。双生病毒卫星DNA β 是一种单链环状DNA分子，依赖于辅助病毒进行复制与运动，并能够从多个方面促进病毒的侵染与传播。前期研究表明卫星DNA β能够编码一个βV1蛋白，在病毒致病过程中起到重要作用。在烟草中表达βV1 蛋白能够诱导明显过敏性坏死反应的产生。. 本项目在此基础上，首先通过共聚焦显微镜与亚细胞分离实验，明确了βV1蛋白是一个内质网定位的蛋白。通过电子显微镜观察，发现βV1蛋白能够诱导内质网形态变化。对βV1蛋白引起坏死的分子机制进行解析，发现当βV1蛋白的C末端20个氨基酸对其诱导叶肉细胞坏死起到关键作用。共聚焦显微镜观察到缺失C末端20个氨基酸的βV1突变体βV1-d81-100-GFP，不能再诱导内质网聚集，说明βV1诱导内质网聚集与引起坏死存在一定联系。同时，通过RT-qPCR检测到，βV1能够诱导内质网胁迫相关基因的转录，而缺失C末端20个氨基酸后则不能再诱导。说明βV1诱导内质网形态的变化及引发细胞过敏性坏死是其通过诱导内质网胁迫所导致的。. 为了检测βV1致病力与诱导内质网胁迫之间的联系，构建了βV1突变体侵染性克隆TYLCCNB-βV1-76s，使βV1蛋白在第76位发生提前终止。与野生型病毒相比，βV1提前终止或缺失βV1的突变体病毒均表现出更弱的侵染性与更低的病毒积累量，说明βV1促进病毒发病的作用主要依赖于其诱导内质网胁迫的能力。. 为进一步明确内质网胁迫与病毒侵染的关系，用内质网胁迫抑制剂4-PBA与TUDCA处理植株，病毒侵染后发现，相比较与对照，抑制剂处理过的植株表型要明显弱于对照植株。利用TRV-VIGS 沉默本氏烟内质网胁迫下游关键基因NbbZIP17与NbbZIP28后进行病毒侵染实验，也能够观察到沉默NbbZIP17/28的植株表现出更弱的病毒表型与更低的病毒积累量，这些结果说明病毒正常侵染需要细胞内质网胁迫及下游UPR的产生。.本项目首次鉴定到双生病毒的βV1蛋白能通过促进细胞内质网胁迫来协助病毒侵染，研究结果为揭示病毒侵染过程的分子机制提供启示，也可为作物抗病毒育种提供理论依据。

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