基于多元半导体纳米晶的急性髓系白血病电化学基因检测新平台的构建及其应用研究

In this work, an ultrasensitive sandwich-type electrochemical biosensor for detection of FLT3 gene, the marker of Acute Myeloid Leukemia (AML), is proposed based on the ECL emission of quaternary semicondutor nanocrystals. Two DNA sequences are designed, and the combined sequences are complementary to that of the target FLT3 sequence. One DNA sequence is immobilized on the carbon nanotubes modified electrodes, the other is labeled with the nanocrystal functionalized amplification platform as probe, and the sandwich format is formed for detecting the FLT3 sequence. The ultrasensitive detection was achieved by the ECL emission of quaternary nanocrystals existing in the amplification platform. The quaternary nanocrystals (CuZnInS3), as a novel green semiconductor nanocrystals, is low-toxicity and environment friendly. Hence, it is very suitable for the biological and clinical application. Here, we use it to construct the amplification platform with polyelectrolytes through the layer-by-layer (LBL) self-assembly method. Different from the traditional strategy, such LBL method make more CuZnInS3 nanocrystals assembled on the substrates and the ECL signal will be further amplified. The self-assembly procedure will be characterized using scanning and transmission electrom microscopy, fluorescence spectra and zeta potential measurements. The resulting amplification platform is used for labelling of DNA in the above ECL biosensor. The efficient signal amplification platform, coupled with the highly sensitive ECL measurement, will give rise to a low detection limit and a high sensitivity toward the target gene FLT3. This new detection route is superior to some other amplified techniques for application in detection of DNA, and opens new opportunities for ultrasensitive detection of other biorecognition events.

肿瘤标志物是辅助癌症诊断、疗效监测的有效指标。FLT3基因作为急性髓系白血病 (AML)的标志性基因，其高灵敏的检测对AML的早期诊断及预后监测至关重要。本项目拟利用新型绿色的多元半导体纳米晶构筑信号放大体系，并将该体系应用于三明治型ECL基因传感器，通过检测多元纳米晶的ECL发光信号量化待测基因的浓度，构建高灵敏度的FLT3基因检测新平台。与传统二元量子点相比，多元纳米晶所含元素毒性较低，可以尽量降低纳米晶带来的生物毒性，使体系更加适用于生物分析；另外，将层层自组装(LBL)技术应用于信号放大体系的构筑，将多元纳米晶高效、可控地组装到碳纳米管表面，使其表面富集更多的多元纳米晶，这无疑对ECL信号具有较强的放大作用，从而有效提高了传感器的灵敏度与检测限。本项目不但为电化学信号放大体系的发展提供了新的策略，也为AML的高灵敏、快速的临床诊断提供了新的方法，具有重要的理论意义和临床应用价值。

肿瘤标志物是辅助癌症诊断、疗效监测的有效指标。FLT3基因作为急性髓系白血病 (AML)的标志性基因，其高灵敏的检测对AML的早期诊断及预后监测至关重要。本项目拟利用新型绿色的多元半导体纳米晶构筑信号放大体系，并将该体系应用于三明治型ECL基因传感器，通过检测多元纳米晶的ECL发光信号量化待测基因的浓度，构建高灵敏度的FLT3基因检测新平台。通过三年的努力，我们首先选择出了FLT3基因中特异性最高的一段基因（23个碱基）作为待测基因B，根据待测基因碱基序列分别设计末端修饰氨基的捕获探针A和标记探针C，两种探针分别与待测探针的前后碱基互补。其次，我们利用吉林大学杨文胜教授的方法，将锌离子引入多元纳米晶，制备了一种高质量的多元纳米晶CuZnInS3，并将其很好的分散在了水相中。由于我们采用了巯基丙酸作为稳定剂，因此多元纳米晶表面带有大量羧基，整体显负电性，因此利用PDDA作为聚电解质，将CuZnInS3层层组装到了碳纳米管表面，形成了信号可控的标记物。将此标记物接枝到标记探针上，并将其利用在三明治型电化学发光平台，通过检测多元纳米晶的ECL发光信号量化待测基因的浓度，构建高灵敏度的FLT3基因检测新平台。该项研究正在数据整理阶段。另外，我们在研究中意外发现另一种简单有效的用于检测肿瘤基因的信号放大体系，即利用目标循环的无酶体系，循环反复的检测目标基因，用于信号增强。我们通过反复摸索与研究，最终确定了两种发夹式的DNA，其中一种DNA与FLT3基因部分互补，并且一端修饰-SH，另一端修饰二茂铁，我们简称H1；而另一种发夹DNA则与H1互补，简称H2。两者均由生物试剂公司合成完毕。在传感器制备过程中，我们将H1修饰到电极表面，由于二茂铁与电极的近距离接触，导致有二茂铁的电化学信号输出；当有目标FLT3存在时，FLT3与H1部分互补，导致H1发夹打开，从而使二茂铁远离电极表面，造成信号减小甚至消失，利用信号减小的程度来确定目标DNA的浓度。另外，当溶液中同时存在H2时，由于H2与H1互补程度大于FLT3，因此H2替代FLT3，将目标FLT3从H1中解放出来，用于下一循环的目标检测，从而达到目标循环的信号放大功能。该体系已经成型，所得数据均已整理完毕，并发表一篇SCI论文，影响因子为6.409 （Biosensors and Bioelectronics）。

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