RNAi沉默CCR3对变应性鼻炎嗜酸性细胞的作用实验研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
81060084
项目类别：
地区科学基金项目
资助金额：
25.0万
负责人：
刘月辉
依托单位：
南昌大学
学科分类：
H1406.耳鼻咽喉头颈科学研究新技术与新方法
结题年份：
2013
批准年份：
2010
项目状态：
已结题
起止时间：
2011-01-01 至2013-12-31

项目参与者：
朱新华；杨春平；刘建国；汪美群；杜兆文；
关键词：
变应性鼻炎.RNAi 嗜酸性细胞 CCR3

项目摘要

变应性鼻炎已成为影响公众健康的严重问题。大量嗜酸性细胞浸润是变应性鼻炎的重要病理特征,也是变应性鼻炎的一个重要发病环节，因此抑制嗜酸性细胞浸润和活化有助于变应性鼻炎疾病过程的控制。近期研究表明，变应性鼻炎不仅是局部疾病也是全身性疾病,控制骨髓中嗜酸性细胞的迁移并促使其凋亡在减轻嗜酸性细胞对变应性鼻炎的影响中起重要的作用。CCR3是嗜酸性细胞的主要表达受体之一,在其迁移、活化中起关键作用，并有促其凋亡的作用。RNAi是通过沉默基因的表达从而达到控制基因的作用，目前在变应性鼻炎研究中，通过沉默CCR3基因进而治疗变应性鼻炎未见报道。为此，本课题运用RNAi沉默嗜酸性细胞CCR3的表达，观察其在控制嗜酸性细胞的迁移、活化及凋亡中的作用，探讨其在变应性鼻炎治疗中的可行性。

结项摘要

本课题首次运用构建慢病毒载体经鼻腔进行RNAi沉默CCR3对变应性鼻炎嗜酸性细胞作用中的影响研究，实验研究结果如下：1）：成功进行了小鼠CCR3慢病毒载体的构建。成功构建了shRNA-mCCR3慢病毒载体，经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察 293T 细胞感染效率大于90%，病毒滴度为4X108TU/ml；Q-PCR测定对嗜酸性细胞CCR3基因沉默效率为86.7%。2）：成功进行了小鼠骨髓细胞的分离及嗜酸性细胞的培养，运用慢病毒介导RNA干扰抑制CCR3基因在嗜酸性细胞上的表达，观察其对小鼠嗜酸性细胞增殖和凋亡的影响，发现RNAi靶向沉默CCR3基因对嗜酸性细胞具有生长抑制作用并能诱导其凋亡。3）：采用鼻腔局部给药，将体外合成的特异性CCR3siRNA重组穿梭质粒（pLVX-ShRNA2-mCCR3-1+2+3+4）应用于小鼠变应性鼻炎模型上，应用逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法分别检测小鼠骨髓、外周血及鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞CCR3及颗粒蛋白mRNA的表达水平，发现针对基因CCR3，给予RNAi 技术的靶向治疗能够抑制变应性鼻炎动物模型中嗜酸性粒细胞的发育、迁移及浸润过程，从而减少嗜酸性粒细胞脱颗粒作用，从而达到减轻变应性鼻炎的炎症反应。4）: 经鼻腔给药，将在体外实验中获得的针对CCR3基因抑制效果最明显的特异性CCR3siRNA 重组质粒载体应用于小鼠过敏性鼻炎模型上，借助HE 染色及瑞氏染色分别检测小鼠鼻腔黏膜病理变化以及骨髓、外周血、鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞比例的改变，发现给予RNAi 技术的靶向治疗能够缓解过敏性鼻炎动物模型中鼻黏膜的Ⅰ型变态反应以及减少动物骨髓、外周血及鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞的数量。5）：运用RT-PCR和western blot方法分别检测各组小鼠骨髓、外周血及鼻腔黏膜中EOS的CCR3基因mRNA及蛋白的表达情况，采用流式细胞仪检测各组小鼠CD34+细胞的变化情况。发现RNAi慢病毒载体沉默CCR3基因，在细胞培养和变应性鼻炎动物模型中都能有效的影响CCR3基因mRNA和蛋白水平的表达，促进EOS凋亡并抑制其发育、迁移及浸润过程。上述结果证实，经鼻腔进行RNAi沉默CCR3减轻了嗜酸性细胞对鼻腔粘膜发病机制的影响，可作为治疗变应性鼻炎的一个新的靶点及途径。