适于神经环路标记的重组腺相关病毒新型高效制备系统

For the current international brain projects, including BRAIN Initiatives in USA and Human Brain Project in Europe,one of the main issues is to elucidate the structures and functions of the complex neural circuits in the brain. The technologies and methods are crucial to realize the goals of these gigantic projects. Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors have been broadly used for transduction of foreign genes in specific type of neurons and for tracing, monitoring, and manipulating the neural circuits. They also play important roles in gene therapy. So far, large scale production of high quality rAAV vectors is still one of the bottlenecks in their applications. The insect baculovirus (Bac) based rAAV production systems developed in recent years seem powerful, but there are still many drawbacks, such as poor flexibility, lacking versatility，low yield and unstable quality of virus production. In this study, based on the basic principles of molecular genetics and virology, we attempt to integrate the components which are necessary for rAAV replication controlling and packaging, the light induced expression technology，and ribosome leaky scanning mechanism to develop novel One Bac systems which are more flexible, applicable and efficient for large scale rAAV production. We will verify the properties of rAAV in the structures and functions study of neural circuits. The results from this project will promote the rAAV applications in neuroscience research, especially with large primate animals as models, and in gene therapy of nervous diseases.

神经环路的结构和功能是目前各类脑工程的核心内容，所需的新技术新方法作为这些巨额工程成功实施的基础而备受关注。重组腺相关病毒（rAAV）已被广泛用于外源基因转导神经细胞，神经环路的标记、监控和操纵，在基础和临床脑科学研究、神经疾病基因治疗等领域发挥着重要作用。但rAAV的大规模制备一直都是限制其应用的瓶颈问题。虽然近年来利用昆虫杆状病毒（Bac）表达系统制备rAAV的方法获得了明显进展，但仍存在灵活性差、通用性低、产量不高、病毒质量不稳定等缺点。本研究拟基于分子遗传学和病毒学基本原理，利用光诱导表达技术和核糖体泄露扫描机制，整合rAAV复制的调控元件和包装所需的组件，建立灵活、通用的大规模制备rAAV的新型One Bac系统，并整合入各类神经环路结构揭示与功能研究体系中，验证其应用效能。项目的成功实施将为神经科学，尤其是对大型灵长类动物的研究，以及神经疾病基因治疗等领域提供高质量的载体工具。

病毒工具在神经环路的结构和功能解析中有着至关重要的作用。重组腺相关病毒（rAAV）在基础和临床脑科学研究、神经疾病基因治疗等领域应用广泛。但rAAV的大规模制备一直都是限制其应用的瓶颈问题。当前基于杆状病毒表达系统的大规模rAAV生产系统仍然方法复杂，成本高，而且缺乏通用性和灵活性。为此，本研究建立了不依赖Sf9包装细胞系的One Bac系统，首先构建了一种能够生产rAAV的新颖的整合了所有rAAV包装元件的重组杆状病毒（BEV）。新系统的BEV感染Sf9细胞所获得的rAAVs产量超过10E+5VG/cell。BEV有很高的稳定性，在至少四次连续传代之后病毒的稳定性没有明显的下降。 新系统制备的rAAV具有很高的病毒质量和转导活性。另外，BEV感染的甜菜夜蛾的幼虫也产生出了rAAV，每个幼虫的产量可以达到 2.75×10E+10 VG。昆虫幼虫产生的rAAV2在结构上与HEK293细胞产生的 rAAV2类似，显示出很高的转导活性。利用昆虫幼虫低成本生产rAAV的新方法具有很大的应用潜力。本研究还建立了依赖Sf9包装细胞系的OneBac系统，包括一个携带组成性表达GFP报告基因和能够在BEV感染后诱导表达AAV Rep基因的通用性高的Sf9/Rep包装细胞系，以及一个同时携带AAV Cap基因和rAAV ITR-GOI基因组的重组杆状病毒BEV/Cap-(ITR-GOI)。通过简单的BEV重建就可以实现不同的Cap基因血清型rAAV的灵活制备。该系统rAAVs的产率达到10E+5 VG/cell，接近国际同类系统的水平。本研究成功建立了大规模高效制备适用于大脑神经细胞标记的rAAV的新技术平台，制备出的rAAV适用于非人灵长类，在猕猴大脑实验中取得了很好的标记效果。总之，本研究的成果有效解决了rAAV大规模高效制备的难题，将有力促进rAAV在神经科学研究以及神经疾病基因治疗等领域的应用发展。

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