新型超高灵敏流式检测仪及纳米生物快速表征系统的研制

纳米生物技术特别是纳米药物载体、纳米生物传感器和成像技术等在生物医学、医药卫生、生化分析等领域有着广泛的应用和明确的产业化前景。此外，自然界存在的众多生物纳米颗粒如细菌、病毒、细胞器、分子组装体等是生命科学研究的热点。发展先进的单个纳米颗粒分析技术，快速、灵敏地对纳米颗粒进行多参数同时表征对于推动纳米生物技术的发展和基础科学研究具有重要意义。虽然单个功能化纳米颗粒表征技术有了突破性的进展，目前仍然处于起步阶段。如果能抓住这一机会，研制新型的多功能纳米生物快速表征系统，选择生物和纳米领域的研究热点和关键问题作为研究对象，将使我国在这一领域的研究处于国际领先水平。申请者将研制具有成像功能的多通道超高灵敏流式检测仪，建立纳米生物快速表征系统，实现对纳米颗粒的尺寸、浓度、化学性能、表面偶联生物分子等性状在单个纳米颗粒水平的多参数同时定量表征，为生物医学与生化分析提供一个全新的视角和强有力的手段。

纳米生物技术特别是纳米药物载体、纳米生物传感器和成像技术等在生物医学、医药卫生、生化分析等领域有着广泛的应用和明确的产业化前景。此外, 自然界存在的众多生物纳米颗粒如细菌、病毒、细胞器、分子组装体等均是生命科学研究的热点。发展先进的单个纳米颗粒分析技术, 快速、灵敏地对纳米颗粒进行多参数同时表征对于推动纳米生物技术的发展和基础科学研究具有重要意义。本项目将单个纳米颗粒的散射光检测灵敏度较传统流式细胞仪提升4-5个数量级，研制成功具有成像功能的多通道超高灵敏流式检测装置，创建纳米生物定量表征新技术，实现纳米颗粒的粒径、浓度、化学性状等的单颗粒水平多参数同时定量表征。.取得的创新性成果概括如下:.1.通过改进超高灵敏流式检测装置的光学系统、进一步压缩样品流直径、选用小探测区尺寸（180 m）的APD单光子探测器等措施，大幅度提升仪器灵敏度, 仪器的散射光通道可以检测到直径为40 nm的单个二氧化硅纳米颗粒, 荧光通道的检测灵敏度为3个Alexa Fluor 555荧光分子。传统的流式细胞仪难以检测到粒径小于200 nm的颗粒，根据瑞利散射定律，纳米颗粒的散射光强度随粒径的6次方衰减，我们自行研制的超高灵敏流式检测装置的散射检测灵敏度较传统的商品化流式细胞仪提升4-5个数量级。.2.研制成功具有成像功能的多通道超高灵敏流式检测装置, 实现了单个纳米颗粒侧向散射和多色荧光的同时定量检测以及颗粒穿越激光探测区时的EMCCD实时图像捕获。具体研制工作包括光路、液流、信号检测系统的搭建，EMCCD触发采样门电路的设计、制作，以及六通道数据采集处理软件的编程。我们还建立了使HSFCM的EMCCD成像模块与多通道检测模块同步的实验方法。.3.利用HSFCM创建了功能化纳米颗粒的多参数定量表征技术, 实现对纳米颗粒的粒径、浓度、化学性状等的单颗粒水平多参数同时定量表征。例如：以二氧化硅纳米颗粒为模型，建立了功能化纳米粒子表面偶联生物分子数量及其分布的快速表征方法；以噬菌体为模型，建立了病毒的尺寸分辨和浓度测定的快速实验手段；发展了脂质纳米药物的粒径、包封率等参数的快速检测方法；建立了单线粒体的多参数检测方法。此外, 以-半乳糖苷酶为模型，建立了单细菌水平低丰度蛋白表达拷贝数及分布的定量检测方法；利用特异性的-内酰胺酶荧光底物探针，发展了单细菌水平的细菌耐药检测方法。

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