基于分子骨架化学衍生与液质联用的细胞分裂素分子识别和精确定量分析

Cytokinins (CKs) are a type of important phytohormones, which regulate the growth of plants, and improve their stress resistances. Therefore, it is extremely important to facilitate the molecular elucidation and accurate quantitation of CKs, in the investigations of plant physiology,. However, due to the complex molecular compositions of CKs and their trace amounts, accurate analyses of CKs are restricted. Typically, the sensitivity and accuracy could be improved through isotope labeling in LC-MS analysis. Therein, the specific functional groups of targeted phytohormones are chemically derivatized and recognized. Unfortunately, there are no such specific functional groups in CKs molecules. Thus, the specific derivatization method for CKs remains challenging. In this project, a pseudo-targeted molecular LC-MS analysis protocol is developed, aiming on recognizing the adenine skeleton of CKs. As such, CKs in plant samples can be thoroughly identified and accurately quantified. After a delicate analysis of the reactivity of each substitutive position on CKs adenine skeleton, stable isotope labeling reagents are rationally designed, so that they can derivatize the adenine skeleton efficiently. Then, the molecular stability and fragmental mass spectra of the labeled CKs derivatives are analyzed, and a collection of such molecules and their fragmental ions is constructed. The research output would be a very important technical support for plant investigations, which also provides a new strategy for developing chemical analysis methods for other natural products bearing active molecular skeletons.

细胞分裂素（CKs）是一类重要的植物激素，能调控植物生长各个阶段，提高植物抗逆性。在植物生理研究中，识别各CKs分子结构并精确定量非常重要。然而，CKs分子组成多样，并且在植物样本中含量极低，限制了CKs的准确分析。通常，针对植物激素目标分子特异性官能团，以稳定同位素标记试剂化学衍生化和液质联用分析可有效提高方法的灵敏度和精确度。但是，CKs分子不具备特异性官能团，其衍生化方法一直是分析工作的难点。本课题拟建立以CKs腺嘌呤分子骨架为导向的拟目标分子液质联用分析方法，全面鉴别植物样品中的CKs，并精确定量。在充分分析CKs腺嘌呤骨架上各取代位点反应活性的基础上，合理设计和制备同位素标记衍生化试剂对该骨架进行标记。通过二级质谱分析衍生物分子稳定性和离子碎片，构建CKs分子及其离子碎片集。课题成果将为植物研究提供重要技术支撑，也为其它具有活性分子骨架的天然产物分析方法研究提供新的思路。

细胞分裂素是植物中最重要的激素成分之一。细胞分裂素家族成员包括多种含有糖基的缀合物，成分复杂。这些成分在反相色谱条件下保留时间较短，分离度不高，常规的液相-质谱分析定量具有技术瓶颈。本项目通过研究醋酸-氰基硼氢化钠、溴代苯硼酸、溴化苄和丹磺酰氯等衍生化试剂对细胞分裂素腺嘌呤骨架的化学标记，认识了细胞分裂素腺嘌呤骨架的反应活性。其中醋酸-氰基硼氢化钠可与腺嘌呤骨架的N-9位亲核取代反应，3-溴-苯硼酸可与细胞分裂素葡萄糖糖缀合物发生双标记反应，溴化苄可同时修饰不含糖基的细胞分裂素和含有糖基的细胞分裂素缀合物，而丹磺酰氯只能与不含糖基的细胞分裂素反应。我们发现腺嘌呤分子骨架上多个反应位点均可与选用的衍生化试剂发生亲核取代反应，但是通常得到多个腺嘌呤骨架上单取代的同分异构体产物。考虑到腺嘌呤分子骨架修饰产物的复杂性，我们尝试通过“子离子扫描”和“母离子扫描”手段，根据Synder-Soczwinski色谱保留规律分析检测到的母离子的色谱保留行为，快速发现衍生化反应产物的母离子，去除不符合色谱保留规律的噪声信号。同时，我们建立了依据色谱保留行为规律预测各目标分子成分的色谱保留时间，从而建立了快速优化色谱梯度条件的数学模拟方法。此外，我们利用本项目的资助成功制备了基于β-环糊精共价有机框架的选择性吸附分离材料，应用于小分子有机物的快速吸附分离。上述研究成果已有5篇论文发表在本领域相关的SCI源期刊上。本项目主持人在项目资助下，参加了2018年中国质谱学术大会，并在会上做了题为“基于色谱保留行为的非靶向液质分析方法”的口头学术报告。.本项目建立的衍生化标记液质联用定量分析方法已应用在甘肃省道地黄芪活体根中细胞分裂素及其糖基缀合物的定量分析，揭示了有机肥和化肥的施用对该中药材内源性细胞分裂素浓度水平的影响。本项研究成果在中药材质量控制方面的应用前景和标准提高方面的应用价值正在进一步探索中。

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