建立新型的基因编辑小鼠生物反应器广谱表达抗肠毒素B（SEB）单克隆抗体

Large-scale production of human recombination functional proteins by transgenic animal bioreactors is a “hot topic” in the field of biotechnology in recent years. However, this technology has two defects: Firstly, the use of random transgenic technology affected the sustained and stable expression of foreign genes, because of the random insertion of foreign protein genes, multiple copies, positional effects and gene silencing etc.; Secondly, commonly used transgenic animals bioreactor such as mammary glands, blood and salivary glands are independent and have some disadvantages that the transgenic animals born are only of specific gender, and the specific lactation period and specific tissue sources (blood, breast or salivary glands) can be used for the production of the recombination functional proteins. These disadvantages greatly limit the utilization of transgenic animals’ bioreactor. We hope to overcome the above shortcomings and to establish a system for the production of antibodies using the large animals in future. Therefore, based on our recently developed the sequence of the Anti-SEB monoclonal antibody, this project will use mice as research objects to establish the Cas9 technology-mediated mouse ROSA26 "safety locus" gene knock-in technique, which was used to ubiquitously express the monoclonal antibodies (MAbs) against Staphylococcal enterotoxin B(SEB). Both the individual health of the mouse and the continuous expression of the SEB monoclonal antibody in the blood, saliva and milk of the mouse will be detected. In summary, our work will provide an important theoretical and technical foundation for the later establishment of gene-editing large animal bioreactor technology for the large-scale preparation of military monoclonal antibodies.

通过转基因动物生物反应器规模化制备功能蛋白是近年来生物技术领域研究的热点。目前此技术存在两个缺陷：1、随机转基因技术存在外源基因随机插入、多拷贝、位置效应、基因沉默等缺点，影响外源基因的持续稳定表达；2、目前常用的乳腺、血液和唾液腺等生物反应器是独立的，各有优缺点，对动物性别、组织来源等有要求，大大限制了转基因动物的利用率。我们期望克服上述缺点，力争建立大动物全身生产抗体平台。本课题将从小鼠模型入手，基于课题组自主研发的抗SEB单克隆抗体序列，建立Cas9技术介导的小鼠ROSA26“安全位点”基因定点敲入技术，制备全身持续性表达目的抗体的基因敲入小鼠，密切关注小鼠遗传特性、生理指标、抗体分泌等指标，为后期建立基因编辑大动物生物反应器技术打下重要的理论和实践基础，实现单克隆抗体的规模化制备。

重组生物制药蛋白对人类临床疾病的治疗和诊断至关重要。其中，单克隆抗体（mAbs）是治疗人类严重疾病的一类重要的生物制药药物，许多药物被列为20种最畅销的生物制药，其需求正在广泛增加。传统的生产平台，如酵母、细菌和哺乳动物细胞，都有生物学和经济上的挑战。另外，使用转基因动物作为生物反应器来生产供人类使用的生物制药蛋白，是将生物技术应用于人类健康方面的一个创新和重要进展。迄今为止，由转基因动物（包括山羊、兔子和鸡）生产的三种药物已获准用于人类，如Rantithrombin、Ruconest和farmaceutical。此外，在最近的两项研究中，报告了在牛乳中生产抗CD20抗体和在山羊乳中生产抗表皮生长因子受体抗体（西妥昔单抗），这说明了大规模生产单克隆抗体的潜力。然而，目前的技术面临一些挑战，如转基因的随机整合、低表达和低利用率，只有特定的性别、特定的时间或特定的组织，如血液、牛奶和唾液可用于表达和纯化重组蛋白。如传统的奶牛乳腺作为生物反应器，只有TG母牛能从其乳汁中产生异源蛋白，而且其性成熟年龄较长，这共同增加了重组蛋白的生产时间和成本。虽然，随着Cas9等Cas系统技术的出现，各种基因编辑动物已经成功制备，但到目前为止，具有安全位点敲入单克隆抗体基因的基因编辑动物还没有报道。因此，迫切需要建立一个新的系统来克服上述障碍。.在此，我们建立了一个新型的基因编辑小鼠生物反应器，该反应器可以泛在地表达mAb。我们利用Cas9技术介导的小鼠ROSA26 "安全位点 "基因敲入技术来泛在表达抗葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体（anti-SEB）。我们通过原核注射Cas9，gRNA及供体载体的方法制备安全位点定点敲入的基因敲入小鼠。ROSA26安全位点定点敲入的F0代阳性小鼠的效率是4.3%（2/46），随后通过与WT配种制备F1代杂合子后代和F2代纯合子后代。我们分别取杂合子和纯合子阳性基因敲入小鼠的血液，唾液及奶样进行anti-SEB单克隆抗体表达的ELISA检测。我们发现在血液，奶和唾液中都有anti-SEB单克隆抗体的表达，而且纯合子小鼠表达高于杂合子小鼠。其中ROSA26位点敲入阳性小鼠血液最高表达180ug/ml，奶中最高表达50ug/m;和唾液18ug/ml。我们观察发现阳性小鼠没有明显的外观异常，而且可以正常繁育。最后我们通过体外抗原结合试验及小鼠攻毒试验证明血液中表达

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