猪RTL1基因DMR甲基化状态对其印记状态及表达水平的调控

Imprinted genes have a significant effect on livestock embryo development and postnatal growth rate, lean meat, meat yields and other quantitative traits. Therefore, identifying more imprinted genes in pigs and analyzing their function and regulation mechanisms have great significance for livestock breeding. This project chose the muscle tissues of porcine embryos at different developmental stages and skeletal muscle satellite cells of different differentiation period as experimental materials, the methods bisulfite sequencing PCR, Realtime RT-PCR, Western blot, EMSA and ChIP are used, to analyze the relationship between RTL1 promoter differentially methylated region (DMR), and its impriting status and expression levels. Meanwhile, identify the relationship between promter SNPs and the porcine production traits. This study is helpful to reveal the regulation mechanism of methylation to RTL1 gene, and lay the foundation for the application of imprinted gene in molecular breeding.

印记基因对家畜胚胎发育及出生后的生长速度、瘦肉率、产肉量等数量性状有极大影响。因此，在猪中鉴定印记基因并分析其功能和表达调控机制，对于家畜育种有重要意义。申请人前期研究表明反转录转座子1（RTL1）基因在猪中表现为母本印记，并且与成肌细胞分化有关，本项目以猪胚胎不同发育阶段的肌肉组织和不同分化时期的骨骼肌卫星细胞为试验材料，利用亚硫酸氢盐直接测序、Realtime RT-PCR、Western blot、EMSA和ChIP等试验方法，分析RTL1基因启动子的差异甲基化区（DMR）甲基化状态与其印记状态及表达水平的关系；同时，研究启动子区SNPs与猪生产性状的关系。本研究有助于揭示DNA甲基化对RTL1基因的表达调控机制，为印记基因应用于分子育种奠定基础。

本项目以猪胚胎不同发育阶段（30日龄、65日龄和100 日龄）的肌肉组织为研究对象，利用亚硫酸氢盐直接测序法（BSP）分析了RTL1基因启动子区甲基化水平，同时用Realtime RT-PCR检测了基因的表达量，发现甲基化水平越高，RTL1基因表达量越低。此外，用甲基化试剂SAM和5-aza-dc处理肌细胞，改变甲基水平，研究基因表达量的变化，发现甲基化抑制基因表达，与肌肉组织中研究结果一致。以上研究表明甲基化水平与基因表达量呈负相关。构建转录因子结合位点突变型pGL3载体，转染细胞，用双荧光素酶报告系统检测启动子活性的变化，发现突变SP1结合位点，启动子活性降低，突变MyoD结合位点，启动子活性升高；通过EMSA和ChIP验证了转录因子与RTL1基因启动子结合情况；通过超表达和RNAi证明转录因子SP1可以上调RTL1基因的表达，MyoD抑制RTL1基因的表达；对RTL1基因启动子区SNPs位点进行了筛选，发现363bp处的T/G突变和395bp处的T/C，并且与猪的生产性状进行了关联分析，发现与部分肉质和胴体性状存在显著相关（P<0.05），可以作为肉质性状遗传改良的新的分子标记。本项目为研究表观遗传学对肌肉生长发育的影响提供新思路，为肉质改良提供了分子理论基础。

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