基因调控原发性开角型青光眼致病基因WDR36对视网膜神经节细胞影响的初步研究

Primary open-angle glaucoma (POAG) lead to progressive optic atrophy and visual field defects. The exact mechanism of POAG has not been elucidated. It had been found that POAG is closely related with WDR36, and functional studies of WDR36 gene are pressing problem. Previous work found that WDR36 and mutations may lead to abnormal spatial structure of proteins, and silencing WDR36 gene could induce apoptosis in RGC-5. The project intends to further study WDR36 mutations in genes and their function in the retinal ganglion cells. In the use of protein spatial structure analysis platform, cell transfection, RNA interference and subretinal injection of constructing experimental rat model, the growing proliferation and cell signaling pathways were observed in vivo, in vitro, respectively. Our research will further reveal the pathogenesis of WDR36 gene in POAG, and give new theories and gene targets for its effective prevention and treatment.

原发性开角型青光眼(POAG)可导致进行性视神经萎缩和视野缺损，其确切的发病机制尚未阐明。研究发现POAG的发病与WDR36基因密切相关，对WDR36基因及功能的研究是急待解决的问题。前期工作我们发现WDR36基因突变可能导致WDR36蛋白空间结构异常，基因沉默WDR36可诱导RGC-5凋亡。本项目拟进一步研究WDR36基因及其突变体的在视网膜神经节细胞中的功能，利用蛋白空间结构分析平台、细胞转染、RNA干扰和大鼠视网膜下腔注射模型构建实验，观察在体内、体外环境下WDR36基因对视网膜神经节细胞的生长增殖的作用，检测WDR36基因参与的细胞信号传导通路及其作用，阐明WDR36基因在POAG发生、发展过程中对视神经的影响，为有效防治POAG提供新的理论基础和基因作用靶点。

目前,青光眼是世界上第一大致盲性眼病。青光眼是一组以进行性视神经损害和视野缺损为主要特征的眼部疾病。临床上常见的青光眼类型是原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)，该型患者生活质量差，预后不良，深入研究原发性开角型青光眼致病机理具有重大意义。到目前为止，明确与POAG 发病相关的基因有三个：MYOC(myocilin)、OPTN（optic neuropathy inducing gene）和WDR36(WD40 repeat 36)（Gene ID 134430)。本实验室在国内率先对WDR36基因进行研究，拟利用转基因技术和RNA 干扰技术研究原发性开角型青光眼致病基因WDR36 及其突变体基因调控相关信号通路，旨在为WDR36基因调控对视网膜神经节细胞损伤及诱发POAG 发病机制研究提供理论依据，同时为临床解决青光眼治疗“瓶颈”提供有益探讨。（1）通过RT-PCR 检测发现WDR36 基因在人胚胎眼Tenon's 囊成纤维细胞(HFTF 细胞)，人胚肾细胞（HEK-293）细胞和大鼠视网膜神经节细胞（RGC-5）中高量表达。（2）细胞免疫印迹检测技术显示WDR36 蛋白在HFTF 细胞，HEK-293 和RGC-5 细胞中大量表达，WDR36蛋白亚细胞定位于细胞质和细胞核。（3）组织免疫荧光技术显示大鼠眼球组织分布WDR36 蛋白表达，尤其是视网膜神经节细胞中大量表达。（4）运用生物信息学设大鼠的21nt WDR36 siRNAs，进行靶位筛选、证实，设立阴性对照，通过real-time PCR 和Western blot 筛选证实一条有效的siRNAs，合成shRNA oligos 并构建到RNA 干扰穿梭质粒载体pGLVU6/Puro，筛选出的高效重组载体和病毒包装质粒共转染 293T 细胞，包装和生产后感染RGC-5 细胞，与对照组相比，RGC-5 细胞内WDR36 蛋白表达显著降低。（5）与对照组相比，实验组细胞出现形态皱缩变形，流式细胞仪检测进一步发现实验组RGC-5 细胞出现细胞凋亡显著增高。（6）我们推测WDR36 基因和蛋白的表达参与细胞生长，增殖，信号转导，并且与视网膜神经节细胞生长发育密切相关。本项研究通过对WDR36 基因的研究，加深对POAG 的理解，丰富和完善POAG的最新学术观点。

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