KCNJ5基因突变导致肾上腺醛固酮腺瘤发生的分子机制

Adrenal cortex aldosterone-producing adenoma (APA) is one of the common causes of secondary hypertension. Its molecular pathogenesis still remains unclear. Our pilot study of 22 APA patients by whole-exome sequencing indicated that KCNJ5 was the only gene with high frequency somatic mutations. The mutation sites G151R and L168R in KCNJ5 had the mutation frequencies of 27.3％ and 45.5％, respectively. In this study, we will verify the mutation frequency of KCNJ5 in ~ 50-100 APA patients and analyze the functions of the hotspot mutations in mouse. CRISPR editing will be conducted on primary cultured tumor cells obtained from the APA patients to modify the mutations back to wild type allele. The cell morphology and cell proliferation rates of normal, mutated and edited wild-type adrenal cells will be compared. Molecular abberations at the transcriptomes and methylation levels of these cells before and after CRISPR editing will be evaluated. KCNJ5 mutations were predicted to affect the blood pressure control and the related genes and signal transduction pathways will also be surveyed to help understanding the relationship between APA and hypertension. This study would help us gaining insight into the pathogenesis of APA and may guide the treatment of APA.

肾上腺醛固酮腺瘤是引起继发性高血压常见原因之一，其致病分子机理尚未明确。我们前期分析了22例病人全外显子序列，发现KCNJ5是唯一的高频体细胞突变基因，其中位点L168R突变率45.5％，G151R突变率27.3％。基于以上发现，本项目拟采用小鼠体内实验，证明突变的致病性。然后对突变患者的肿瘤细胞进行原代细胞培养，并用CRISPR技术在细胞水平将上述突变热点修复。在细胞水平比较正常肾上腺细胞，突变细胞以及编辑后的野生型细胞在细胞形态、增殖速度等方面的差异。进一步通过 mRNA测序和甲基化测序，分别寻找正常肾上腺细胞，突变细胞以及编辑修复细胞在转录和甲基化水平的差异。找到KCNJ5蛋白突变影响的控制血压有关的重要基因及相关信号通路，进一步阐明KCNJ5基因突变导致肾上腺醛固酮腺瘤发生的分子机制。为肾上腺醛固酮腺瘤的治疗提供新的途径。

KCNJ5是一种G蛋白门控离子通道基因。在醛固酮产生的肾上腺腺瘤（APA）的研究中发现，T503G and G451C 两种体细胞突变是APAs发病的最主要原因。KCNJ5这两个体细胞突变会导致通道选择性丧失和膜去极化，从而引起高血压。我们将基因突变引发的的一系列分子水平的变化作为该研究的重点。通过CRISPR/Cas9技术将SW-13细胞系做了T503G和G451C修改，生成两株全新具有T503G和G451C突变型的模式细胞株。我们挑选突变体细胞系，并分别对原始野生型突变兴细胞系做了WGS，WTS，WGBS测序，从而找到突变后的多组学变化以及突变引起的分子变化机制。研究发现，经过CRISPR/Cas9处理后，绝大部分的差异表达都是因为甲基化变异造成的，真正由于KCNJ5突变引起的表达差异基因较少，而导致醛固酮增多的原因是膜通道蛋白KCNJ5突变后，细胞内钠离子增多。我们用指示探针方法鉴定细胞胞浆内钠离子，钾离子和钙离子浓度，发现KCNJ5突变细胞系中，钠离子升高明显，钾离子和钙离子无明显差异，而突变体的醛固酮有明显增加。这也说明KCNJ5突变主要作用于钠离子的跨膜运储。钠离子增加导致去极化，钙离子通道打开，钙离子在细胞胞浆内浓度变高，通过级联反应，产生高浓度醛固酮，醛固酮增多，醛固酮增加，引发血钾降低。

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