自毒胁迫下杉木可变剪接与microRNA相互调控网络研究

Chinese fir is an important afforestation tree species in southern China. Continuous cropping will cause decline on woodland production. Autotoxicity is a major factor for declining production. However, the molecular regulation mechanism upon autotoxicity stress is unclear at present. The study of autotoxicity in Chinese fir can provide not only theoretical value about cropping obstacles, but crucial application on improving land productivity. Alternative splicing and microRNA were two important post-transcriptional regulations and plays an important role in response to the stress responses from outside world. Therefore, this project will focus on enhancing Chinese fir production by exploring mutual regulation of alternative splicing and microRNA network upon autotoxicity stress. It included four aspects: 1) alternative splicing of the precursor miRNA sequences; 2) alternative splicing of miRNA synthesis, degradation and function gene; 3) alternative splicing of miRNA target sites; 4) miRNA regulation splicing factor. In this study, bioinformatics and molecular biology will be integrated to investigate the regulation of alternative splicing and miRNA upon autotoxicity stress to obtain important genes that are closely related in the mutual regulation networks upon autotoxicity stress. This item not only elucidates the transcriptional regulatory network, but also provied important theoretical basis for solving cropping obstacles and improving woodland production for the southern Chinese fir.

杉木是我国南方重要的造林树种，而连作障碍会导致林地产量下降，自毒作用是导致产量下降的一个主要因素。目前自毒胁迫的应答机理还不清楚，因此研究自毒作用不仅对理解连作障碍具有理论价值，而且对提高林地产量至关重要。可变剪接与microRNA作为重要的转录后调控，在植物对外界胁迫应答方面扮演着重要的角色。因此本项目以杉木产量提高需求为导向，重点探索自毒胁迫下二者相互调控网络：1）可变剪接对miRNA前体序列的调控；2）可变剪接对miRNA合成基因、降解基因和功能基因的调控；3）可变剪接对miRNA靶标位点的调控；4）miRNA反过来对拼接因子的调控。本研究将综合运用多学科交叉，解析自毒物质处理前后可变剪接与microRNA之间相互调控网络的变化。以期筛选出这个相互调控网络中与自毒作用密切相关的关键基因。在阐明转录后调控网络的同时，也能为解决南方杉木林连作障碍和提高林地产量提供重要的理论依据。

通过对杉木进行不同时间梯度下（0h、8h、32h、56h）的邻羟基苯甲酸和其他几种非生物胁迫下的植物生理实验，完成了MDA、SOD、POD四种生理指标的测定工作，阐释了这些生理指标在自毒胁迫下的变化情况。通过Nanopore单分子测序和二代高通量测序相结合，发现 AP2/ERF、WRKY、NAC、bZIP等关键转录因子参与了多种胁迫响应的信号通路。在自毒胁迫处理早期（8h）可以检测到1594个可变剪接事件，发现邻羟基苯甲酸胁迫处理下活性氧（ROS）代谢、激素信号转导等相关基因明显被激活。特别是在邻羟基苯甲酸处理下有9个miRNA合成基因和4个miRNA功能基因受到可变剪切的调控。通过小分子RNA测序识别自毒胁迫下杉木中有245个miRNA，其中73个在不同胁迫处理下的不同时间差异表达，并按计划通过降解组测序识别了79个有实验证据的miRNA靶标位点。识别可变剪接调控和miRNA的交互调控网络发现乙烯响应相关转录因子通过内含子滞留事件来达到调控miR172a靶位点，并发现miRNA调控基因中除了转录因子外，还有部分为RNA结合蛋白。通过上述结果构建了可变剪接和miRNA在自毒协迫下的相互调控网络。开发了杉木基因功能验证实验体系，包括原生质体的转化体系和杉木病毒诱导基因沉默系统。发现次生木质部相对比较好游离出原生质体。通过将剥皮后的茎段放入纤维素酶和离析酶中消化可以获得足够多用于遗传转化的原生质体。通过GFP荧光定位实验显示原生质体体系过表达外源基因十分成功。同时建立了杉木病毒诱导基因沉默系统及其构建方法，使用该方法可以根据植株表型的变化来探究目标基因的功能机制，该VIGS体系的建立对林木裸子植物功能基因的研究具有开创性的意义。

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