条斑紫菜跨类囊体膜质子动力势与光合电子传递的调控机制

Photoprotection is crucial for photosynthetic organisms to avoid or reduce high light induced oxidative damages. Viridiplantae regulate the trans-thylakoid membrane proton motive force (pmf), xanthophyll cycle and PSBS/LHCSR to induce the conformational changes of LHCII, dissipating the excessive energy into harmless heat, i.e. non-photochemical quenching (NPQ). The red algae do not have evolved LHCII. We propose that the rapid photoprotective responses in red algae are regulated mainly on the pmf level. However, the detailed mechanisms remain unclear. In this project, Pyropia yezoensis, one of the most high light-tolerant intertidal red algae, will be subjected to resolve the pmf kinetics under various light intensities by measurements of the ECS-induced dual-beam difference signal, and of the fluorescence changes of acridine orange. The difference of the pmf kinetics in the gametophytes and sporophytes of P. yezoensis would be compared and analyzed. The contributions of ΔpH and Δψ to the pmf level would be analyzed. The genes encoding the thylakoid membrane-located ATP synthase-γ subunit would be cloned and sequenced. The possible regulation mechanism of thylakoid membrane-located ATP synthase and their expression levels in the gametophyte and sporophyte would also be compared. The thylakoid membrane proteomics would be performed to dig the potential ion channels/transporter in the thylakoid membrane. After the accomplishment of this project, a more complete picture could be achieved about the relationship between the high light-tolerant and the pmf, and their regulation mechanism. Our results would also be valuable for resolving the evolutionary history of photoprotection mechanisms in photosynthetic organisms.

光保护机制对植物响应高光胁迫避免氧化性损伤至关重要。绿色植物通过调节跨类囊体膜(Tm)质子动力势（pmf）、叶黄素循环和PSBS/LHCSR诱导LHCII构象改变，进而形成NPQ，快速将多余光能转化为无害的热，避免或减少光损伤。红藻没有LHCII，我们认为它的快速光保护性响应可能仍停留在pmf调控阶段，但是具体机制仍不十分明确。本项目拟以潮间带耐高光红藻代表物种——条斑紫菜为材料，分别通过差示光谱吸收法和荧光染料法表征不同世代条斑紫菜响应高光胁迫时的pmf动力学特征，分析ΔpH和Δψ两种组分对pmf形成的贡献；克隆Tm上ATP合酶-γ亚基基因，分析其序列特征和调控机制，比较其表达的世代差异性；开展Tm蛋白质组学研究，寻找潜在的离子通道蛋白。本项目的完成将有助于解析条斑紫菜等红藻pmf介导的光合电子传递和光保护调控机制，对研究光合生物光保护机制的进化路径具有重要理论参考价值。

光保护机制是光合生物响应环境光变化、避免或减小光能过剩造成的氧化性损伤的重要适应机制，是影响光合固碳效率的重要因素。光保护机制涉及到光合作用过程中的光反应和暗反应的各个阶段，甚至与细胞内其它细胞器之间也存在互作，包括类囊体膜上的捕光天线蛋白（如高光诱导蛋白）、光合色素（如玉米黄素等）、类囊体膜上调节跨膜质子梯度的离子通道蛋白（如位于类囊体膜上的特殊钾离子通道）以及由叶绿体、过氧化物酶体和线粒体协同完成的光呼吸过程等。因此，不同类型的光合生物，如高等植物、真核藻类以及蓝细菌等，其光保护调控机制差异巨大。条斑紫菜（Neopyropia yezoensis）是一种生长于潮间带的大型红藻，具有极强的适应逆境环境的光保护能力，不仅具有重要的经济价值，同时也是研究光保护调控机制的重要实验材料。.项目围绕条斑紫菜响应高光逆境胁迫的分子机制开展研究工作。项目团队基于目前的条斑紫菜分子遗传研究现状，重点关注了条斑紫菜反向遗传学研究重要工具载体的构建，克隆验证了条斑紫菜多个内源性II型和III型启动子的效率，构建了用于功能基因敲除、敲降以及过表达的DNA载体，为条斑紫菜反向遗传学研究奠定了基础。分析了条斑紫菜基因组中参与调控跨膜质子动力势（pmf）的关键基因信息，克隆了这些基因的序列，构建了相应的沉默和过表达载体质粒；比较分析了条斑紫菜不同世代（二倍丝状体和单倍叶状体）孢子细胞的基因转录差异，揭示了单孢子和壳孢子在发育和生长差异的分子基础；通过遗传改造获得了多个与高光响应密切相关的功能基因突变藻株，阐释了这些基因在条斑紫菜响应高光胁迫中的作用。研究发现，条斑紫菜NyHLIP基因的表达受到抑制后，突变株的光合活性显著低于野生型，同时其PSI和P700还原速率也发生了明显的变化，然而其NPQ却并没有显著的变化。这些结果表明NyHLIP在高光下维持条斑紫菜PSII基本活性发挥重要作用。研究还发现定位于线粒体中的γ-CAL在条斑紫菜适应高光胁迫、调控光合固碳与光呼吸过程中发挥重要作用，并提出了条斑紫菜叶状体细胞的叶绿体、线粒体以及过氧化物酶体协同适应高光环境，从而降低光呼吸、实现高效固碳的可能的分子机制。

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