微生物群落结构分析中被遗漏新类型微生物的挖掘

Most of microbial community and functional microbial population analyses depend on PCR amplification with “universal” primers. However, because of the coverage limitation of “universal” primers, many of microbial taxa and functional microbial types would be missed. In this project, we will screen phylum-level unclassified 16S rRNA sequences which unmatched with “universal” primers from metatranscriptome datasets, and design specific primers based on these screened sequences to seek novel microbial taxa. We will modify metatranscriptome based microbial community analysis method to get products of reverse transcription of full length 16S rRNA to seek novel microbial phyla or classes. Next, we will design highly degenerated primers for microbial nutrient cycle related functional marker genes based on metagenome data sets in public databases, and modify and apply the two-step PCR method with highly degenerate primer to seek novel functional microbial types. Based on single cell genomes or metagenomes of the sought novel microbes in this project, will further analyze their physiological and ecological characteristics. The finding of novel microbes will not only dramatically expand the people knowledge boundary of microbial taxa and function, but also play an important role in the development of original microbial resources and in-depth understanding of global nutrient cycles.

常规的微生物群落和功能微生物种群的分析方法都依赖基于“通用”引物的PCR扩增。但由于“通用”引物覆盖度的局限性，很多微生物种类和功能微生物类型被遗漏。本课题基于从元转录组数据集筛选得到的不被“通用”引物覆盖的、在门水平未分类的16S rRNA序列，设计特异性引物来发现新的微生物候选门或纲；改进基于元转录组的微生物群落结构分析方法，得到全长16S rRNA反转录产物，用于发现新的微生物种类；基于公共数据库中元基因组数据集，设计物质循环相关特定功能微生物marker基因的高简并引物，改进和应用本实验室建立的基于加tag高简并引物的两步PCR方法，发现新类型功能微生物；在此基础上，基于所发现新类型微生物的单细胞基因组或元基因组分析，研究其生理生化特点和生态作用。新类型微生物的发现将进一步扩展人们对微生物种类和功能的认知疆域，为原创性微生物资源的开发及全球物质循环的深入认识具有重要意义。

本研究中根据宏转录组中16S rRNA数据，筛选出跟常用“通用”引物不匹配的未分类微生物相关序列，基于这些序列重新设计引物来检测到了新类型的阿斯加德古生菌；建立了只用一个“通用”引物的、基于近全长16S rRNA来分析活性微生物群落结构的方法，应用在人体微生物组分析。利用基于宏基因组数据中筛选特定功能基因序列构建数据库来评价和改进引物的方法，设计了针对氨氧化细菌氨单加氧酶基因的新的“通用”引物，扩展了覆盖度，发现原来常用于氨氧化细菌群落结构分析的“通用”引物不能覆盖滩涂的主要氨氧化细菌；结合基于所设计的新引物的定量PCR分析，从滩涂样品富集培养了此类微生物，初步分析了其基因组。并且，结合高简并引物两步PCR方法，检测并筛选分离到质粒上携带含铜膜结合单加氧酶超级家族的烃单加氧酶基因的红球菌属的菌，并通过实验确认此质粒可传递给其它菌使受体菌获得短链烷烃氧化功能。此外，通过不同孔径滤膜的分级过滤装置，在0.1m滤膜上检测到了新类型的古生菌。这些新探索的检测被“遗漏”微生物的方法将有助于更多新功能微生物和新类型微生物的发现和富集培养，并扩展对生态系统中微生物的认识。

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