剪接体复合物的组装及工作机理研究

Important progress has been made in structural biology in recent years. Atomic or subatomic structures of many desired targets have been resolved. Nevertheless, the structural information on the physiologically significant eukaryotic spliceosome remains limited. In eukaryotes, the maturation of nascent pre-messenger RNA (mRNA) requires the removal of introns and joining of exons, a very dynamic and complex process known as splicing that is executed by spliceosome in nucleus. Spliceosome comprises five small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs), namely U1/U2/U4/U5/U6, as well as a number of co-factors and enzymes. Each snRNP consists of one major small nuclear RNA and a specific heptameric protein complex. The heptameric ring in U6 snRNP comprises Lsm proteins, whereas the other snRNPs each contains a Sm protein ring. The Lsm heptamer specifically recognizes the 3’ fragment of U6 snRNA, assisting its binding to other components of spliceosome, and facilitating splicing of precursor messenger RNAs. In our previous study, we have determined the crystal structure of Lsm2-8 bound to a fragment of the 3’-end of U6 snRNA at 2.8 angstrom resolution and the related Lsm1-7 complex structure in 3.0 angstrom resolution. Despite the exciting progress, many important questions remain to be addressed. We aim at the structural and mechanistic understanding of the assembly and function of spliceosome. As part of the very ambitious project, we plan to focus on the study of U6 snRNP at a start. Structural and functional analysis of the assembly of U6 snRNP will offer us a great deal to the understanding of spliceosome.

由于技术及硬件的进步，结构生物学近年来取得了一系列重要突破。然而，对于真核生物RNA剪接体(spliceosome)的结构生物学研究却一直进展缓慢。新转录出来的RNA要成为具有执行翻译功能的mRNA，需要在细胞核内经历一个非常复杂的剪切和拼接过程。这个过程是由五个小核核糖核蛋白（U1/U2/U4/U5/U6）和一系列辅助蛋白构成的巨大分子机器—剪接体执行的。小核核糖核蛋白主要由一条小核RNA和与之特异性结合的七元环蛋白复合物组成。大部分的七元环复合物是Sm 蛋白七聚体，只有在U6小核核糖核蛋白中为Lsm蛋白七聚体复合物。该申请项目计划利用结构生物学和生物化学手段，在本课题组已经取得的前期成果基础上深入研究剪接体的组装及工作机理，阐明各个小核核糖体的组装形式以及它们特异识别靶标RNA的分子基础，力图攻坚这一结构生物学领域最具挑战性的课题之一。

RNA剪接是真核生物基因表达的中心步骤。由大分子机器剪接体催化完成。人类超过95%的基因会发生RNA剪接，35%的遗传紊乱与错误的RNA剪接及剪接体相关。研究剪接体催化RNA剪接的分子机理，具有重要的科学意义及应用价值。而获取剪接体在催化反应各个状态的三维结构是其必经之路。.我的课题组一直致力于剪接体结构与机理的研究。2013年，我们获得了剪接体U6 snRNP亚复合物晶体结构，随后，在重点项目资助下，我们开始向解析完整剪接体的高分辨率三维结构发起挑战，取得了一系列重大科研成果。.在反复优化样品制备方案之后，我的课题组于2015年解析了分辨率达3.6埃的裂殖酵母剪接体冷冻电镜结构，这是世界上首个完整剪接体近原子分辨率三维结构。包含37个蛋白和4条RNA、分子量高达2MDa以上，完整揭示了剪接体的整体结构及组装。该结构的核心区域分辨率达到3.0埃以内，清晰地揭示了催化活性中心的精细结构，它被中心组分Prp8蛋白锚定在剪接体的中心，由U2、U6、U5三条核内小RNA组成，两个起催化作用的镁离子被U6 snRNA的分子内茎环结构配位结合。为揭示剪接体是金属核酶的本质提供了强有力的证据。.随后，我的课题组开展了对酵母及人源不同状态剪接体的高分辨率结构的研究工作。在酿酒酵母系统中，我们利用内源提取和体外组装的方法，捕获了所有8个完全组装剪接体基本状态及重要复合物U4/U6.U5 tri-snRNP的三维结构，分别是3.8Å的tri-snRNP 、3.3~4.6Å的pre-B、3.9Å的B、3.5Å的Bact、2.7~3.8Å的B*、3.4Å的C、4.0Å的C*、3.6Å的P和3.5Å的ILS复合物。这些结构完整覆盖了RNA剪接过程，从分子层面揭示了剪接体催化RNA剪接的机制。在人源剪接体结构研究中，我们利用体外剪接反应捕获了7个状态的剪接体的高分辨率结构，分别是5.7Å的pre-B、3.8Å的B、3.4~6.5Å的Bact、4.1Å的C、3.7Å的C*、3.0Å的P和2.9Å的ILS复合物，为揭示高等生物剪接体工作机理提供结构基础。.这一系列成果从根本上增进了我们对于真核生物中心法则关键步骤的理解，推动了RNA剪接领域的发展，为探索相关疾病的致病机理和药物开发提供基础。

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