OsRhoGAP2与OsRacD在水稻育性控制中功能及其相互作用研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31171182
项目类别：
面上项目
资助金额：
50.0万
负责人：
梁卫红
依托单位：
河南师范大学
学科分类：
C0602.基因表达及非编码序列调控
结题年份：
2015
批准年份：
2011
项目状态：
已结题
起止时间：
2012-01-01 至2015-12-31

项目参与者：
刘海英；邵云；杨献光；刘洪梅；石宏浩；张帆；
关键词：
水稻育性控制蛋白相互作用 OsRacD OsRhoGAP2 调控

项目摘要

OsRhoGAP2是以水稻育性相关基因OsRacD为诱饵，通过酵母双杂交从雌雄蕊形成期的幼穗中筛选到的调控OsRacD鸟苷酸结合形式的互作蛋白。本研究拟采用RNAi技术分别沉默OsRacD和OsRhoGAP2基因，确定二者在水稻育性控制中功能和联系；通过实时PCR、原位杂交等方法检测二者在水稻幼穗中的表达特性，确定基因表达和水稻育性的相关性；采用CoIP或BiFC实验鉴定二者的相互作用，并结合PCR介导的突变技术进一步确定其互作方式；采用亲和层析和GTP酶活性分析等方法鉴定OsRacD蛋白的活性是否因OsRhoGAP2的沉默而改变，确定在水稻幼穗中OsRhoGAP2对OsRacD活性调控的机制。本项目的完成就将明确OsRhoGAP2和OsRacD在水稻育性控制中的作用，以及二者的相互作用在水稻幼穗发育中的功能联系。

结项摘要

本项目基于多年的工作积累，申请人读博期间，以信号通路中“开关分子”水稻ROP基因OsRacD（OsRac5）为诱饵，采用酵母双杂交技术从水稻雌雄蕊形成期幼穗中筛选到若干潜在相互作用蛋白的编码基因，包括2种调节ROP内在GTP酶活性的RhoGAP/RopGAP基因OsRhoGAP1和OsRhoGAP2。鉴于OsRhoGAP2和OsRacD在水稻幼穗中都具有高表达的特性；在酵母双杂交系统中，OsRhoGAP2只与锁定在GTP结合形式的OsRacD结合，具备信号通路中下游效应物的基本特性；且前期已经通过过表达转基因实验证实OsRacD与水稻育性控制有关。因此为了明确OsRhoGAP2 和OsRacD 在水稻育性控制中的作用，以及二者的相互作用在水稻幼穗发育中的功能联系，本项目采用过表达和RNAi 技术确定OsRacD 和OsRhoGAP2 基因在水稻育性控制中功能和联系，研究内容包括OsRacD 和OsRhoGAP2 基因RNAi水稻的构建以及与育性的关系、二者在水稻幼穗中的表达相关性的分析、蛋白相互作用的体内鉴定以及OsRacD 蛋白的活性是否因OsRhoGAP2 的沉默而改变。对OsRacD 和OsRhoGAP2 基因RNAi水稻T0代的穗部性状统计显示，二者的穗长、穗粒数都增加、千粒重都下降的特点。OsRhoGAP2 基因过表达水稻T2代的统计显示，分蘖、有效分蘖显著提高，提示OsRacD 和OsRhoGAP2 基因与水稻幼穗发育过程有关，尤其是与产量相关的穗粒数、穗长、有效分蘖性状，值得深入探讨其生产应用的前景。对OsRacD 和OsRhoGAP2 基因表达特性的检测显示，除了在都具有幼穗中高表达的特性，高盐胁迫能诱导二者3倍以上的上调表达，6-BA和IAA都能显著诱导该基因的表达，但是OsRacD在地上部分的表达受GA诱导的效应极为显著，提示二者的表达既具有协同性，也具有组织差异性。利用GFP融合技术和洋葱表皮细胞转化，证实OsRhoGAP2定位在细胞膜上，有助于构建OsRacD与OsRhoGAP2相互作用的模型。通过对OsRhoGAP2 基因启动子的克隆、序列缺失和转基因实验，研究该基因的表达调控机制，目前已经获得6个缺失片段的转基因拟南芥植株，组织化学分析显示，该基因的启动子A片段能够启动报告基因在花中的特异性表达，有助于解析该基因在水稻幼穗发育中的功能。