一种新的淋病奈瑟菌丝氨酸蛋白酶自转运蛋白的功能及致病作用研究

Autotransporter proteins constitute a large family of extracellular proteins that contribute to bacterial virulence, involved in bacterial adhesion colonization,invasion,immune escape, cytotoxicity and other processes. Our previous results found that NGO2105 protein is a new kind of serine protease transporter in Neisseria gonorrhoeae FA1090 strain. Bacteria liquid PCR showed that ngo2105 gene is highly conserved among different ST types of Neisseria gonorrhoeae.NGO2105 protein was successfully cloned and expressed in Escherichia coli in our previous research. Polyclonal antibody of NGO2105 protein was prepared. Further studies showed that polyclonal antiserum of NGO2105 showed higher bactericidal specificity compared with the control serum. These results suggested that it may be a promising target for protein vaccine. Antibody adhesion inhibition experiments showed that the polyclonal antiserum of NGO2105 could significantly inhibit the adhesion ability of neisseria gonorrhea on urinary epithelial cell. We propose that NGO2105 protein may participate in the adhesion process. But the function and pathogenic role of NGO2105 is unclear. To answer this question,we investigated the autotransporter features and serine protease activity of NGO2105 by use of subcellular localization analysis and gene mutation technology.Further,cell adhesion, complement deposition and mice infection experiment were determined to reveal the pathogenic roles of NGO2105 protein. This study may elucidate the biological function and pathogenic role of NGO2105 protein, and can help to better.understand the pathogenesis role of serine protease autotransporter in Neisseria gonorrhoeae.These works will paly a significance role in looking for new antibacterial and vaccine targets.

自转运蛋白是革兰阴性菌中重要的毒力因子，参与细菌的粘附定植、侵袭、免疫逃逸、细胞毒性等致病过程。本课题组前期研究首次发现，淋病奈瑟菌FA1090菌株基因编码产物中存在一种新的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白——NGO2105蛋白。进一步研究发现该蛋白在不同淋病奈瑟菌菌株间高度保守，且能诱导宿主产生杀菌性抗体，提示其可能是较有潜力的蛋白疫苗靶点。此外，用制备的NGO2105蛋白抗体能显著抑制淋病奈瑟菌对尿道上皮细胞的粘附能力，提示该蛋白可能在粘附过程中发挥重要作用。基于上述基础，我们认为深入探讨NGO2105蛋白的生物学功能及致病机制，对淋病奈瑟菌感染的防治具有重要意义。因此，本课题拟采用亚细胞定位分析、基因突变等技术，重点分析NGO2105蛋白的自转运特征及丝氨酸蛋白酶活性；通过NGO2105基因敲除和回复技术评价淋病奈瑟菌的粘附侵袭、补体沉积和小鼠感染定植能力，以揭示NGO2105蛋白的致病作用。

自转运蛋白是革兰阴性菌中一类重要的毒力因子，在细菌致病过程中发挥着重要作用。根据自转运蛋白的典型组成结构域，我们通过序列比对发现NGO2105蛋白可能是淋病奈瑟菌FA1090菌株中一种新的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白。本课题拟对NGO2105蛋白自转运特征及其在致病过程中的作用进行研究，以期为深入了解淋病奈瑟菌的致病机理和探寻新的蛋白疫苗靶点提供实验依据。我们首先构建了ngo2105基因敲除菌株和ngo2105基因回复菌株。流式细胞术及Western blot分析结果显示，NGO2105蛋白定位于菌体表面，并通过自体水解切割，分泌至外环境。众所周知，一些自动转运蛋白的translocator结构域不仅可以运输自身的passenger结构域，还可以运输异源passenger结构域。因此，我们将大肠杆菌自转运蛋白Hbp的passenger结构域与NGO2105蛋白的translocator结构域融合，通过分析Hbp的passenger结构域蛋白表面定位。结果显示Hbp蛋白passenger结构域定位于细菌表面，提示NGO2105蛋白translocator结构域具有转运异源蛋白的功能。为验证NGO2105蛋白的丝氨酸蛋白酶活性是否参与其passenger结构域的自酶切与分泌过程，我们将NGO2105蛋白酶活性中心的催化三联体结构中的267位丝氨酸突变为丙氨酸。Western blot分析结果显示S267A点突变后NGO2105蛋白passenger结构域不能被水解切割后分泌至培养基。流式细胞分析显示NGO2105（S267A）仍可定位于细菌表面，提示NGO2105蛋白的丝氨酸蛋白酶活性介导passenger结构域的自体切割及分泌过程。细胞粘附实验结果显示淋病奈瑟菌Δngo2105菌株的粘附、侵袭能力相对于野生菌株显著下降，抗NGO2105抗体和抗passenger抗体能够抑制淋病奈瑟菌的粘附作用。小鼠阴道定植实验结果显示淋病奈瑟菌Δngo2105菌株在体内定植能力较野生菌显著下降，抗NGO2105抗体能够抑制淋病奈瑟菌在阴道内的定植能力。综上所述，我们的研究证明NGO2105是淋病奈瑟菌中一种新的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白，其在淋病奈瑟菌的粘附、侵袭及小鼠阴道内定植过程中发挥着重要作用，是淋病奈瑟菌致病过程中一种重要的毒力因子。

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