H7N9禽流感病毒PB2基因人类适应性突变规律及其临床意义研究

Since March 2013, avian influenza A (H7N9) virus has crossed the species barrier to infect humans and continued threatening humans. Previous studies suggest that the adaptive mutation of PB2 gene of avian influenza A (H7N9) virus is the molecular basis for its continuous infection. However, most prior studies on adaptive mutation of PB2 gene of avian influenza A (H7N9) virus, concentrated on animal experiments. The patterns, interactions and clinical significance of the adaptive mutation of PB2 gene of avian influenza A (H7N9) virus remain unclear. This study used the technology of bioinformatics and high-throughput sequencing to scan and verify the new adaptive mutations sites of PB2 gene of avian influenza A (H7N9) virus, to discover the interactions of overlap multiple adaptive mutations in PB2 gene of avian influenza A (H7N9) virus, to reveal the patterns of human adaptive mutation of PB2 gene of avian influenza A (H7N9) virus, and to clarify the role of PB2 gene in the infection and long-term circulation of avian influenza A (H7N9) virus in humans. Meanwhile, using prospective cohort design, our study aimed to construct a Cox model with time-dependent covariates, which could estimate the association between the adaptive mutation of PB2 gene and prognosis of human H7N9 virus infection, provide scientific evidence for clinical diagnosis, prediction of epidemic trend, and the development prevention measures.

H7N9禽流感病毒突破了种属屏障感染人类并持续威胁人类健康，该病毒PB2基因适应性突变是其持续感染人类并形成有效传播的分子基础，但目前有关PB2基因突变研究处于动物实验水平的验证，尚未见PB2基因突变规律、重叠突变交互作用及其临床意义研究的报道。本研究采用高通量测序和生物信息学技术，扫描和验证H7N9禽流感病毒PB2基因准种分布和新的适应性突变位点、分析PB2基因多种突变重叠交互作用及其适应性突变规律，探索PB2基因在H7N9禽流感病毒感染人类并长期循环中的作用；同时，采用前瞻性队列研究设计，研究建立PB2基因适应性突变对人感染H7N9禽流感病例治疗和预后影响的时间依赖协变量Cox回归分析模型，评估PB2基因适应性突变及其相关协变量对人感染H7N9禽流感病例预后的风险，对临床病例发生危重症或死亡进行早期预警和早期治疗，为人感染H7N9禽流感临床诊治、疫情研判、防治措施制定提供科学依据。

自1997年以来，禽流感病毒(H7N9、H5N1、H7N7和H9N2等)跨物种传播感染人类被不断报道，对人类健康造成巨大的潜在威胁。本研究旨在通过了解禽流感病毒在禽类和人类中的流行变化和病毒基因池的演变，发现并验证潜在的H7N9禽流感病毒在人类适应性突变位点，从而进一步解释禽流感病毒跨种传播以及在人群中传播的潜在机制，同时探索病毒感染后发生重症感染或死亡的影响因素。本研究通过收集临床病例资料及文献数据进行流行病学分析以阐明感染者特征，通过反向遗传学等分子生物学及细胞学技术阐明基因突变位点及其临床意义。研究结果发现在中国禽流感病毒在禽类中流行较为平稳，H7亚型的流行主要为H7N9亚型，而H5亚型流行株由以H5N1为主逐渐转换以H5N6为主H5N1为辅。在流感病毒序列库中发现已检测到79种亚型，中国的所有省份均已检出甲型流感病毒，H7N9亚型在环境样本中较为常见。对基因库进行进一步分析新发现了两种可疑的适应性突变位点V292I及D740A，分析发现PB2-292I突变在过去六年间占比逐渐增多。PB2-292I与627K位点偶联增强病毒的转录和复制力。在H7N9感染的临床病例中，以男性，年长者较多。感染后以重症病例多见，早期感染无特异性，发病到入院中位时间5天。对H7N9聚集性病例的疾病特征和病毒基因组特征进行分析，共发现了41次聚集性疫情。指示病例死亡率67.8%明显高于二代病例2.2%。在医院发生聚集性感染的有7起，二代病例多为年长者，二代死亡病例平均年龄68.5岁。从可疑人传人病例分离到的病毒毒株中发现E627K（28/35）是最常见的适应性突变位点，M535L次之（15/35），本课题发现的新的适应性突变位点V292I亦在可疑人传人分离毒株中发现占比为6/35，且所有突变均与627K偶联。本项目研究结果揭示了人感染H7N9禽流感病毒PB2基因上V292I这个新的潜在适应性突变位点；PB2-292I突变在过去六年间占比逐渐增多；PB2-292I与627K位点偶联增强病毒的转录和复制力。研究结果为进一步了解H7N9病毒的跨种传播提供了证据，解释了禽流感病毒跨种传播的潜在机制，为人感染H7N9禽流感临床诊治和群体预警防控提供重要的科学依据。

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