基于霍乱毒素AB5结构的个体化自组装抗癌疫苗的研究

In the field of cancer immunotherapy, peptide vaccine development lags behind the cell and nucleic acid vaccine. How to develop a better adjuvant to induce cytotoxic T lymphocyte proliferation, improve the immunogenicity of antigen peptide, establish a convenient way for polypeptide combination are the problems urgently to be solved for the development of antitumor polypeptides vaccine. This study aimed to design a new type of anti-prostate cancer polypeptides vaccine. The polypeptide vaccine structure is based on the AB5 molecular structure of the cholera toxin, containing a cytokine adjuvant and five antigen epitopes in the same macromolecule. The subunits within the macromolecule are formed a self-assembly structure, which is stable and let the epitopes do not influence each other. It can improve the weak immunogenicity of antitumor polypeptide epitopes, make it more convenient to change the composition of polypeptide vaccines. We aim to obtain valuable antitumor polypeptide vaccine candidates through this research, and provide a beneficial reference for the design of polypeptide vaccines against tumor. In addition, as the mutual recognition of the antigen peptides and the T cells is the first step of the activation of toxicity of antitumor T cell, this research will also provide useful information for the development of cell vaccine.

在肿瘤免疫治疗领域，多肽疫苗研发滞后于细胞疫苗和核酸疫苗。如何研发更好的能辅助诱导毒性T淋巴细胞增殖的佐剂，提高抗原肽的免疫原性，建立方便快捷的多肽组合方式是发展抗肿瘤多肽疫苗亟待解决的问题。本研究拟针对抗肿瘤多肽疫苗存在的上述问题，设计构建一种新型的抗前列腺癌多肽疫苗。该多肽疫苗基于霍乱毒素AB5分子结构，在同一大分子内同时包含细胞因子佐剂和五个抗原表位，各亚基借助霍乱毒素分子的自组装结构稳定结合且不相互影响，在解决抗肿瘤多肽表位免疫原性弱的基础上，能方便快捷的实现分子内多表位自组装，适应肿瘤个体化免疫治疗需要，且可利用霍乱毒素的黏膜佐剂特性实现无创给药。本研究在获得有价值抗肿瘤候选疫苗的同时，也对抗肿瘤多肽疫苗的设计提供有益的参考。此外，由于抗原肽和T细胞的相互识别是抗肿瘤毒性T淋巴细胞活化的第一步，对于该新型自组装多肽抗肿瘤疫苗的研究也将为细胞疫苗的研发提供重要参考。

肿瘤免疫疗法日渐受到关注。在与肿瘤免疫疗法相关的疫苗中（如细胞疫苗、RNA/DNA疫苗），肽疫苗的发展显著滞后。虽然研究者在实验室筛选到很多抗原肽，但是临床效果不佳。有些研究者认为其原因是已经长出肿瘤的微环境中存在对T细胞的抑制作用，肽免疫没有办法再产生逆转作用。但也有人认为免疫原性是肽疫苗失败的关键。如果在多肽的结构、佐剂以及给药途径方面进行改进，肽疫苗仍有望在临床上发挥应有的作用。因此，我们设计了一种具有佐剂作用，能增强DC成熟并靶向前列腺癌的新型嵌合蛋白。通过质粒构建和大肠杆菌原核表达系统表达纯化了多个蛋白，并使用之前授权专利技术进行了嵌合蛋白的复性，获得候选疫苗。通过GM1-ELISA实验鉴定嵌合蛋白有加强与鼻黏膜受体GM1的结合作用；在髓系细胞增殖实验中，嵌合蛋白具有与市售的鼠源GM-CSF相同的促进细胞增殖的趋势；滴鼻免疫小鼠后，体外通过ConA与PSMA624-632刺激，嵌合蛋白显示出有效地增强刺激T细胞增殖的效果；通过流式分析，与嵌合蛋白在体外共孵育的DC可见更长的突触，CD86表达量也明显上调；为了能让小鼠前列腺癌RM-1细胞表达人源的PSMA，建立候选疫苗的筛选平台，我们通过细胞转染质粒pEF1-myc-his-PSMA-EGFP获得能表达人肿瘤抗原的小鼠前列腺癌细胞系。通过激光共聚焦分析发现转染后的质粒表达具有绿色荧光的PSMA蛋白，且表达在细胞膜上，与前列腺癌抗原PSMA的表达位置相同，说明成功构建了能表达前列腺癌抗原的小鼠肿瘤细胞。在小鼠模型中，我们用转染成功的肿瘤细胞接种C57BL/6J小鼠，经嵌合蛋白免疫后的小鼠表现了延迟肿瘤生长的作用。通过本研究工作的开展，我们在本实验室建立了肿瘤自组装疫苗的蛋白质表达方法和平台，可用于表位肽疫苗的表达纯化；建立了快速简便的嵌合六聚体蛋白复性方法，可以用于不同表位肽疫苗的快速自组装，并且建立了体内外评估候选疫苗效果的方法，特别是一种经确证可以表达在小鼠前列腺癌细胞表面的人前列腺癌抗原细胞系的建立，可以用于体内评估筛选前列腺癌抗原PSMA相关表位肽的研究。本研究在获得有价值抗肿瘤候选疫苗的同时，也对抗肿瘤多肽疫苗的设计提供了有益的参考。此外，由于抗原肽和T细胞的相互识别是抗肿瘤毒性T淋巴细胞活化的第一步，对于该新型自组装多肽抗肿瘤疫苗的研究也将为细胞疫苗的研发提供重要参考。

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