梅毒螺旋体tprK差异基因的筛查及在梅毒血清固定诊断中的价值评估

The incidence rate of syphilis serofast reaction is very high, but it is lack of early diagnostic index, which has been a tough challenge in clinical practice. We have found that there is special Treponema pallidum (Tp) subtype closely related to syphilis serofast reaction. But the existing Tp-DNA gene typing method is of low efficiency, which limits its clinical application. Fortunately, our previous study indicated that differential tprK genes of in the syphilis serofast patients has its own regularity, which could become a potential targets marker for the diagnosis of syphilis serofast reaction.We will conduct following studies: Using next-generation sequencing technology (HiSeq 2000 system）to identify the sequence of tprK gene . By comparing the tprK from different types of syphilis patients and TprK from different types of Tp strains, we get the special differential tprK site in syphilis serofast patients. By sequencing the TprK at different time points after infection of dissimilar Tp types into rabbits, we get the special tprK mutation site in signal serofast reaction Tp strain. Using the rabbit model to confirm whether the above selected diagnostic target site of tprK could be used in diagnosing the syphilis serofast reaction. Then, all of these sequencing results are analyzed by bioinformatics method, we primarily get the diagnostic target site (multiple) of tprK special for syphilis serofast reaction. Using the rabbit model to confirm whether the above selected diagnostic target site of tprK could be used in diagnosing the syphilis serofast reaction. After that, we at last get the certain diagnostic target site of tprK; Besides, we built a new multiple real-time fluorescent quantitative PCR based on above TprK gene sequencing to screening the early syphilis serofast reaction, and evaluate its clinical application. This study will contribute to screening a new diagnostic marker for syphilis serofast patient, so as to probably solve the long-term difficulties in clinical.

梅毒血清固定现象发生率高，缺乏早期诊断指标，长期困扰着临床。我们研究发现：该类患者的梅毒螺旋体（Tp）存在优势基因型别；但现有Tp分型方法效率低而限制其应用；进一步研究发现该类患者的tprK基因具有异质性，有望成为诊断的分子靶标。本项目拟：采用二代测序技术（HiSeq 2000 系统）对tprK 基因进行测序，应用渐进比对的生物信息学方法分别进行不同临床类型梅毒患者之间，以及不同基因型别Tp之间的tprK基因比较，结合Tp进入机体后 tprK基因突变研究，筛选获得梅毒血清固定患者特征性tprK基因；进一步应用兔感染实验，验证特征性tprK基因的致梅毒血清固定作用，最终确认可应用于梅毒血清固定诊断的分子靶标（理论上有多个）；构建多重荧光定量PCR技术检测特征tprK基因，用于梅毒血清固定早期诊断，并开展临床应用评估。本研究为梅毒血清固定早期诊断筛选标志物，有望解决长期困扰临床的难点。

梅毒的早期诊断指标一直困扰着临床。我们采用二代测序技术分析一期和二期梅毒患者来源的tprK 基因进行测序，应用生物信息学方法分别进行不同临床类型梅毒患者之间tprK基因和蛋白序列的比较。发现不论在一期或者二期梅毒患者体内，梅毒螺旋体tprK基因的7个可变区均存在不同序列的混合。在计算每个可变区内不同序列所占比例时，发现除了可以用先前的克隆-Sanger测序方法检测到的主要序列之外，标本中的梅毒螺旋体tprK基因可变区均都含有许多次要变体，并且这些变体相对频率主要集中1-5%之间。与一期梅毒患者体内的tprK基因可变区多样性比较，二期梅毒患者体中tprK基因其7个可变区发现了更多的混合性变体，并且可变区内主要序列的频率普遍降低（小于80%），同时伴随着分布在10-60%频率之间的次要变体比例增高。有趣的是，分析每个可变区内所获得的不同序列长度时，发现每个可变区内变体的序列长度变化仅相差3bp或为3bp的倍数。此外，在氨基酸水平上研究tprK基因可变区的多样性，发现每个可变区内的氨基酸序列在不同来源的个体之间，即不同菌株间，存在一定程度的序列共享性。通过比较每个可变区序列在种间的共享性程度，发现在这28个菌株的tprK基因可变区内保持一些比较稳定的氨基酸序列。特别是，V1中的氨基酸序列IASDGGAIKH和IASEDGSAGNLKH不仅呈现出高比例的种群间共享性，并且在种群中呈现相对高的频率（高于80%）。此外，研究进一步确认了tprK基因在直接人源性标本中，其V6区不仅在自身株内，还在不同株之间表现出显著的多样性。为进一步的梅毒诊断标志物的筛查奠定基础。尚需要进一步优化血液样本提取梅毒螺旋体DNA的流程，提高血液梅毒螺旋体DNA的得率，分析梅毒血清固定患者来源的tprK 基因序列特征，筛选梅毒血清固定tprK 基因序列特征。

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