基于表型不一致成年同卵双生子的肥胖全基因组甲基化谱和表达谱分析

Altered DNA methylation triggered by genetic, environmental and stochastic effects accumulated over time can contribute to the development of individual susceptibility to complex diseases such as obesity. For complex diseases, the comparison of discordant monozygotic (MZ) twins represents a powerful improvement over the traditional case-control study to search for disease-associated DNA methylation. However, few genome-wide DNA methylomic analyses of obesity discordant MZ twins based on high throughput sequencing has been reported. This project aims at conducting the first extensive epigenetic study on obesity in Chinese. The discovery stage will include 30 pairs of BMI-discordant MZ twins (intra-pair difference in BMI ≥5 kg/m2) from Qingdao Twin Registry. Genome-wide methylation and gene expression profiles in peripheral blood leukocytes will be quantified based on Illumina HiSeq platform. Differentially methylated and expressed sites found in the discovery stage will be selected for further confirmation in replication stage with 800 cases and 800 controls who are unrelated individuals from Qingdao Diabetes Preventions Project Cohort. MassARRAY system will be used for testing the methylatic alteration in replication stage. Sites that remained significant in replication cohort will be proceeded for gene set enrichment analysis. The study is expected to deepen our understanding of obesity molecular mechanism and to help with development of more efficient prevention and treatment strategies.

研究表明，肥胖的发生发展与DNA甲基化有关，而DNA甲基化受基因和环境因素共同影响。表型不一致同卵双生子拥有相同的基因序列，在复杂疾病的DNA甲基化研究中，能消除基因序列不同带来的混杂效应，提高把握度。本课题拟应用高通量测序技术，基于肥胖表型不一致同卵成年双生子，开展两阶段全基因组DNA甲基化研究：发现阶段，选择对内体质指数差异≥5kg/m2同卵双生子30对，提取其外周血白细胞DNA和mRNA，定量检测全基因组DNA甲基化水平和基因表达量，寻找差异甲基化区域和差异表达基因；通过甲基化谱和表达谱联合分析，筛出潜在的功能性甲基化异常基因。验证阶段，从非相关人群中选择肥胖病例和体重正常对照各800名，对发现阶段的差异基因位点进行MassArray甲基化检测，验证肥胖相关的DNA甲基化改变，并对差异基因开展富集分析，明确其所富集的生物学功能和通路。研究结果可为制定肥胖的预防和治疗策略提供依据。

肥胖的发生发展与DNA甲基化有关，而DNA甲基化受基因和环境因素共同影响。表型不一致同卵（MZ）双生子拥有相同的基因序列，在复杂疾病的DNA甲基化研究中，能消除基因序列不同带来的混杂效应，提高把握度。本研究应用高通量测序技术，基于肥胖表型不一致同卵成年双生子，开展全表观基因组关联研究（EWAS），探索山东籍汉族成人肥胖相关的DNA甲基化改变。.从青岛市双生子登记系统中选择肥胖表型不一致山东籍汉族MZ双生子，提取外周血白细胞DNA和mRNA，应用简化亚硫酸氢盐测序技术定量检测全基因组DNA甲基化水平，基于Illumina HiSeq 2500平台定量检测基因表达量。使用ReFACTor方法校正细胞类型异质性。采用R软件拟合线性混合效应模型，调整混杂因素，分析单个胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CPG)位点甲基化水平与肥胖表型间的关联。通过comb-p软件鉴定与肥胖表型相关的差异甲基化区域（DMR）。使用基因组区域富集注释工具（GREAT）开展基因富集分析。通过基因表达分析验证差异甲基化基因分析结果。.30对体质指数（BMI）不一致（BMI≥3kg/m2）MZ双生子单个CpG位点关联分析，共获得2个P<1×10-6，30个P< 1×10-5 和136个P < 1×10-4 CpGs位点，涉及52个基因，区域分析共得到9个DMRs（FDR< 0.05），基因富集分析鉴定出位列前10位的通路涉及生物发育、编码细胞外基质和细胞外基质相关蛋白，以及神经系统等。基因表达分析发现差异甲基化基因中有7个基因的表达水平与BMI相关。60对腰臀比（WHR）不一致（WHR>0）MZ双生子单个CpG位点关联分析（调整BMI），共获得92个P < 1×10-4 CpGs位点，涉及31个基因，区域分析共得到14个DMRs（FDR< 0.05），基因富集分析鉴定出位列前10位的通路涉及Notch信号通路、吡哆醛磷酸盐挽救通路、烟碱乙酰胆碱受体信号通路和线粒体l -肉碱穿梭通路等。.本研究确定了多个与山东籍汉族成人肥胖相关的DNA甲基化位点、基因和区域，其中有8个基因DNA甲基化被既往欧洲或非洲人群肥胖研究所报道，其余基因DNA甲基化与肥胖的关系尚未被报道。这些已知或未知的肥胖相关DNA甲基化改变可能为肥胖发生发展的分子机制研究提供新的思路。

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