转录因子RUNX1在家族性血小板疾病和巨核细胞生成中的作用机理研究

Megakaryocyte (MK) is a highly polyploidy cell type that can efficiently generate platelet in bone marrow. Germline heterozygous mutation of transcription factor RUNX1 causes defective megakaryopoiesis and familial platelet disorder (FPD). However, the molecular mechanisms underlying deregulated megakaryopoiesis in FPD remain unclear. In this study, we use two unique research models to find novel factors regulated by RUNX1, which are used to promote MK generation in vitro. 1) Megakaryocytic differentiation from the FPD patient-derived pluripotent stem cells (iPSCs) was indeed defective, while RUNX1-corrected isogenic iPSCs restored the MK formation. 2) A transgenic mouse model, in which megakaryocytes are marked by GFP, can be used to sort polyploid MKs with high efficiency. We have previously proved that it is feasible to find potential RUNX1 target genes/pathways by combining the FPD-iPSCs system with functional genomics. To examine whether the candidate genes can improve MK production and polyploidization, we carry out gene knockout (KO) experiments by CRISPR/Cas9 or overexpression experiments in the established stem cell differentiation system, followed by in vivo or in vitro functional assays. Then gene editing or small chemical compounds can be applied to promote megakaryocyte generation in vitro. Our study is expected to reveal the mechanism of RUNX1 in the development of platelet related disorder and normal megakaryopoiesis, and improve our understanding in the efficient megakaryocyte production in vitro, which has important scientific significance and clinical implications.

巨核细胞（MK）是骨髓中高度多倍体化且高效生成血小板的重要细胞。转录因子RUNX1单等位基因胚系突变会引起MK发育障碍和血小板减少的家族性血小板疾病（FPD），但具体机制不清。本项目应用两种独特的模型来寻找RUNX1相关的新调控因子，促进功能血细胞的体外再生：1）FPD病人来源的多能干细胞（hiPSCs）可体外模拟病人MK发育障碍的表型，而RUNX1突变修正后，MK生成缺陷被纠正；2）绿色荧光标记MK的小鼠模型，可高效地分离体内不同倍体的MK。我们前期工作发现功能基因组分析可在上述模型中找到受RUNX1调控的潜在关键基因/通路。本研究利用敲除或过表达靶基因技术结合体内外功能实验，确定候选基因在促进MK生成和多倍体形成中的关键作用。进而利用基因编辑或小分子化合物促进体外MK再生。本研究有望揭示RUNX1在FPD和MK生成中的作用机制，有助于改进体外产生MK的效率，有较高的科学意义和临床价值。

巨核细胞（MK）是骨髓中生成血小板（产板）的前体细胞。转录因子RUNX1单等位基因突变会引起MK发育障碍和血小板减少的家族性血小板疾病（FPD），但具体机制不清。本项目应用FPD疾病干细胞模型，结合小鼠模型以及功能基因组学手段，寻找可促进MK生成的重要调控因子，解析MK的高效产板群体，进而促进血小板再生以及治疗血小板疾病等。首先，FPD病人来源的多能干细胞（hiPSCs）可体外模拟病人MK发育障碍的表型，而RUNX1突变修正后，MK生成缺陷被纠正。利用该疾病干细胞模型结合功能基因组学手段，我们发现RUNX1通过结合在NOTCH4第29个内含子上，抑制了NOTCH4的表达，进而促进MK发育。而利用CRISPR/Cas9技术敲除NOTCH4基因以后，明显促进多能干细胞体外产生MK的产量。我们进一步筛选出Notch通路的小分子抑制剂，使得从多能干细胞和脐血来源的造血干/祖细胞，生成MK的产量提高近十倍。接着，我们高效地分离了小鼠体内不同倍体的MK，利用单细胞转录组学分析揭示了体内具有不同功能特征的MK亚群，包括：产板亚群、维持造血干细胞微环境亚群和免疫调节亚群。通过解析不同功能MK亚群的转录组特征及分子标记，我们发现产板MK亚群分子标记为ARNTL，且具有高效的产板能力，为体内MK高效产板的研究奠定了基础。综上，我们的研究不仅找到了可促进MK体外再生的新靶点NOTCH4，还发现了MK体内高效产板的群体和路径。该成果不仅促进了MK /血小板再生的研究，而且推动了巨核谱系发育的基础科学，为血小板疾病的临床治疗提供新思路和新策略。

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