NOS和Arg在克山病外周血单核细胞中对线粒体生物合成影响

The key problems on mechanism of mitochondria injury of Keshan disease is not clear. In recent years, some mitochondrial-related differential expression genes, pathways and networks in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in Keshan disease were screened by Human Mitochondria-Focused cDNA Microarray. Based on these results, field investigation combinded with cell culture, quantitative real-time PCR, western blot, and other methods were used to study the effect of nitric oxide synthase (NOS) and Arginase (Arg) on mitochondrial biogenesis in peripheral blood monouclear cells from patients with Keshan disease, to establish the connection between the gene expression in myocardial tissue and gene expression in PBMCs. It provides basis for understanding the mechanism of myocardial mitochondria injury. Moreover it offers new clues for the nitric oxide therapy of myocardial diseases and the establishing of significant potential diagnostic or prognosis indicators of Keshan disease.

针对克山病心肌线粒体损伤机制不明的关键问题，基于近年来利用线粒体芯片筛选克山病外周血单核细胞差异表达基因、通路及网络所取得的进展，采用现场人群结合细胞培养、实时定量PCR、western blot等方法，分别从RNA、蛋白及代谢水平研究精氨酸酶和一氧化氮合酶在克山病外周血单核细胞对线粒体生物合成的影响机制，建立克山病外周血单核细胞基因表达和心肌组织基因表达之间的联系，为克山病线粒体损伤机制的阐明提出依据，为克山病治疗或预后提供有意义的潜在诊断指标，并为心肌疾病的一氧化氮治疗提供新的线索。

背景：克山病是一种以环境因素为主并涉及环境反应基因的地方性心肌病，病因至今未明。PGC-1 在线粒体生物合成的转录调节过程中具有重要作用。前期研究表明克山病PBMCs 中PGC-1α 较病区对照表达升高。本研究从多层面比较线粒体生物合成通路涉及关键分子在患者表达情况，利用KD活性氧损伤细胞模型分析此通路分子变化、作用机制及硒对其影响，为克山病病因机制及防治提供线索。方法：1.依据克山病诊断标准（WS/T210–2011），在知情和同意下收集17例病例及10例病区对照外周血样本。采用QRT-PCR等技术从基因、蛋白水平分析Arg2、NOS1 及PGC-1α表达水平；2. 采用电感耦合等离子体-质谱法检测24份病例及对照全血硒浓度。3.分别采用过氧化氢200μmol/L建立活性氧损伤AC16细胞模型及亚硒酸钠干预组0.05 mol/L、0.5mol/L、2mol/L。采用试剂盒检测不同干预组CCK-8及丙二醛含量。4. Western blot检测各干预组NOS1、Arg2及PGC1α蛋白水平；采用试剂盒等方法检测各组NO及ATP含量。结果：1. 病例年龄53.82±9.96岁，均为慢克；对照年龄44.40±12.02岁；与对照相比，Arg2, NOS1及PGC-1αmRNA表达水平在KD与对照组差异无统计学意义（P>0.05），但KD组三种蛋白表达均显著升高（P<0.05）；2. 两组全血硒水平差异无统计学差异；3. 随双氧水浓度增高，细胞凋亡率逐渐增加。与对照组相比，其余各组MDA 含量均显著升高；与H2O2 组相比，其他各加硒组MDA含量均显著降低；4. H2O2相较于对照组NOS1、Arg2及PGC1α蛋白表达水平均显著升高。2mol/L亚硒酸钠组 NOS1、Arg2及PGC1α均显著升高；与对照组相比，H2O2组、0.05mol/L 硒组和0.5mol/L 硒组NO含量显著降低（P<0.05）。与H2O2组相比，2mol/L 硒组NO含量显著升高。与对照组相比，H2O2组、0.05 mol/L 硒组和0.5 mol/L 硒组ATP含量显著降低。与H2O2组相比，对照组和2 mol/L硒组ATP含量显著升高。结论：PGC-1介导线粒体生物合成通路可能参与克山病发病机制。KD及活性氧模型中PGC-1介导线粒体生物合成通路分子均异常表达，一定浓度硒对此具有保护作用。

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