高表达氨代谢双通路关键酶的HepG2细胞筛选及功能研究

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项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    30972926
  • 项目类别：
    面上项目
  • 资助金额：
    30.0万
  • 负责人：
    唐南洪
  • 依托单位：
    福建医科大学
  • 学科分类：
    H0311.肝保护和人工肝
  • 结题年份：
    2012
  • 批准年份：
    2009
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2010-01-01 至2012-12-31
  • 项目参与者：
    王晓茜； 朱金海； 李秀金； 陈红英； 孟泽武； 王燕；
  • 关键词：
    肝细胞代谢酶氨

项目摘要

前期研究表明，可用于生物人工肝系统的肝癌细胞株HepG2的氨代谢功能不足，原因在于氨代谢两条通路上的关键酶- - - - 人谷氨酰胺合成酶（hGS）、人精氨酸酶I（hArgI）和人鸟氨酸转氨酶（hOTC）表达低下或缺失。本研究通过克隆hGS、hArgI和hOTC的cDNA并通过双基因表达载体分别将hGS与hArgI或hOTC基因导入HepG2细胞、hArgI和hOTC基因导入HepG2-hGS或HepG2-AFhGS细胞（前期构建），筛选培养抗性细胞株。利用基因芯片技术分析转hGS、hArgI和hOTC基因对HepG2细胞基因表达谱的影响，定量PCR、Westernblot和生化酶学分析氨代谢酶的表达以及对氨代谢能力的影响，分析细胞增殖、周期和凋亡的改变；从中选择降氨功能最强最稳定的细胞株，微载体聚集培养后组装于混合型生物人工肝系统并进行肝衰模型的治疗，评价其应用价值。

结项摘要

目的：本研究通过双基因真核表达载体将通路2（尿素代谢通路）的人精氨酸酶1（hArgI）基因和人鸟氨酸转氨酶（hOTC）基因导入氨代谢功能低下的人肝癌细胞株HepG2，从而获得具有强降氨能力的细胞株；并将通路1（谷氨酰胺代谢通路）的人谷氨酰胺合成酶（hGS）基因导入通路2恢复的HepG2细胞，通过氨代谢双通路关键酶的过表达，比较氨代谢双通路的恢复对HepG2细胞生物学功能的影响。另外，通过构建微型生物人工肝系统（BAL），评估所获得细胞株的实验应用价值。.结果：（1）HepG2/hArgI1、HepG2/hOTC2和HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞成功建立并证实过表达hArgI或/和hOTC；HepG2/hArgI1和HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞的hArgI酶活力以及HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞的hOTC酶活力均高于对照细胞（P<0.05）；hArgI或/和hOTC的过表达促进了氨代谢其它相关蛋白的表达。HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞的耐氨能力显著提高，是HepG2的3倍，达到人原代肝细胞的3/8；降氨能力上，在NH4Cl浓度达180mM浓度时，尿素生成量是HepG2的3.1倍，达到人原代肝细胞的63.1%；在NH4Cl浓度为120mM和Glu浓度为15mM时，Gln生成量是HepG2的3.1倍，达到人原代肝细胞的36.0%。（2）HepG2/AFhGS和HepG2/hArgI+hOTC+AFhGS细胞的耐氨能力、在高浓度氨环境下的尿素和谷氨酰胺生成量均显著高于对照细胞（P<0.05）。（3）尽管生存分析显示实验组间的差别没有统计学意义，但HepG2/(ArgI+OTC)4细胞治疗组的肝衰模型耐氨和降氨能力还是较HepG2细胞治疗组有很大提高（P<0.05），其他各项生化指标也都优于HepG2细胞治疗组（P<0.05）。.结论：（1）体内外实验证明HepG2/(hArgI+hOTC)4具有强降氨能力。（2）高表达hGS的HepG2/hArgI+hOTC+AFhGS细胞株在体外培养的降氨能力不如HepG2/AFhGS和HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞，氨代谢双通路关键酶的过表达并不能进一步提高HepG2细胞的氨代谢能力。（3）自行构建的简易微型生物人工肝系统能为各种侯选细胞材料的治疗应用提供良好的研究平台。

项目成果

期刊论文数量（2）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
基于生物人工肝细胞材料研究新进展
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    --
  • 期刊：
    福建医科大学学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    张飞媛;唐南洪
  • 通讯作者：
    唐南洪

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

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          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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