新疆地区人乳头状瘤病毒16型上游调控区突变体启动子活性和复制功能的研究

项目拟以人乳头状瘤病毒16型(human papillomavirus type 16，HPV-16) 标准株的上游调控区（Upstream Regulatory Region，URR）为参照，研究新疆地区HPV-16 URR突变体的启动子活性和复制功能。内容包括：1.将URR突变体插入荧光素酶基因前，重组质粒单独转染或与HPV-16 E1和E2基因双表达质粒共转染哺乳动物细胞，用荧光素酶活性分析、实时荧光定量PCR、Southern Blot等技术定量分析URR突变及其与E1、E2蛋白协同对URR启动子活性和复制功能的影响。2.用蛋白DNA过滤结合、凝胶阻滞和DNase足迹等技术分析URR突变体和E1蛋白的结合能力。3.探讨雌激素对URR突变体启动子活性和复制功能的影响。该项研究将揭示新疆地区HPV-16 URR突变与该地区宫颈癌高发间的内在联系。

项目以HPV-16标准株的URR和E1为参照，研究新疆HPV-16 URR和E1/dup突变体对HPV-16早期启动子活性和病毒复制的影响。内容包括：1. 为探讨E1/dup在宫颈癌中的分布及病毒的整合状态，对215例宫颈标本中HPV-16 E1/dup以及病毒基因组整合状态进行分析，结果显示宫颈癌中E1/dup突变率（48.10%）显著高于宫颈炎（15.79%）（P<0.05）和CIN（15.79%）（P<0.05）；E1/dup突变病样中HPV16整合率（69.05%）明显高于未发生E1/dup突变的病样(41.89%)（P<0.05）。以上结果提示E1/dup与病毒致癌活性及病毒整合相关。2. 为检测E1/dup通过URR对病毒DNA复制和早期启动子活性的影响，将表达E1和E2的质粒与URR调控荧光素酶基因的质粒pGL3-URR共转染细胞，分析 E1、E2 蛋白协同对 URR功能的影响。结果表明E1/dup结合E1、增强DNA复制以及增强启动子活性的功能均强于E1/ref。以上结果提示E1/dup与HPV-16持续感染和宫颈癌发生有关。3. 为检测新疆地区HPV-16 URR突变及其启动子活性,对215例宫颈病样中分离的URR序列进行分析，并检测代表性URR突变体的启动子活性。结果显示，215例样本中共检测到44个突变位点，其中新疆地区普遍存在的突变有4个，部分病样存在的突变有2个，其他突变发生频率较低；不同URR突变体的启动子活性存在较大差异。以上结果表明新疆地区HPV-16 URR存在广泛突变，并导致URR启动子的改变。4. 为探讨雌孕激素对新疆地区HPV-16 URR突变体启动子活性的影响，将插入URR突变体的pGL3 /URR重组质粒转染细胞，并添加雌孕激素检测其对URR启动子活性的影响。结果表明，添加雌孕激素后29个URR突变体启动子活性增强，部分URR突变体增幅显著，4个突变体启动子活性降低。以上结果说明雌孕激素可激活多数HPV-16 URR突变体启动子活性，HPV-16 URR突变可能影响激素与其反应元件的结合，并改变启动子活性。5、其他研究，表达、纯化获得E1蛋白并制备了高效价的HPV-16 E1蛋白抗血清；HPV-16在HEK293T细胞中瞬时复制的研究；基于基因芯片分析新疆维吾尔族宫颈癌组织的基因表达谱。

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