腹泻儿童鼠伤寒沙门菌spv对自噬的作用及其分子机制的研究

Salmonellosis does great harms to children's health.Moderate autophagy is helpful to the host defense to the infection caused by salmonella，in which various signaling pathways play a pivotal role.Spv virulence gene can regulating the autophagy-associated factors, including p38 and NADPH.However,could spv exert a role in autophagy? Previous studies suggested that S. Typhirium is the main serotype in salmonella isolated from the children with diarrhea in Jiangxi district. In suicide plasmid constructed spvB-deficient mutant strain,the expression of autophagosome-specific marker protein LC3Ⅱ and autophagy-related gene Beclin-1 was up-regulated,which indicated that the change of spv expression could regulate autophagy.In this research, we plan to utilize human gastrointestinal epithelial cells and S. Typhirium we isolated before, construct spvBC-deficient mutant strain using suicide plasmid, establish spvBC retro-complementary strain by electroporation and carry out in vivo and vitro trials in order to clarify the influence of spv in autophagy , autophagy-related genes and signaling pathways,as well as the interaction of these pathways,to discuss the potential mechanism for the purpose of providing new research approach and target for guiding the clinical treatment to Salmonellosis and setting up the molecular basis for Subsequent research on the difference of the influence of spv in autophagy between antibiotic-resistant S. Typhirium and non-resistant S. Typhirium and the underlying mechanism.

沙门菌感染所致疾病严重危害儿童健康，适度的自噬有利于机体对沙门菌感染的防御，多种信号通路在其中发挥重要作用。沙门菌的毒力基因spv能调控p38、NADPH等自噬的关键因子。那么，spv能否影响自噬？前期研究发现，从江西地区腹泻儿童中分离的沙门菌中，鼠伤寒沙门菌是主要的血清型，利用自杀质粒构建的spvB缺陷菌株中自噬体标记蛋白LC3Ⅱ及自噬相关基因Beclin-1表达上调，提示spv表达的改变可以调节宿主细胞的自噬。为此，本课题拟以江西南昌地区腹泻儿童临床样本中分离的spv高表达的鼠伤寒沙门菌为研究对象，通过自杀质粒构建基因缺陷变异株，利用电转化制备缺陷变异株回补株，体内外实验观察下调spv表达后对自噬、自噬相关基因、信号通路的影响及信号通路间相互作用，并探讨可能机制，为沙门菌感染的临床治疗提供新的研究思路和靶点，为进一步探讨耐药及非耐药沙门菌株中spv对自噬影响的差异及其分子机制奠定基础。

沙门菌感染所致疾病严重危害儿童健康，鼠伤寒沙门菌是主要的血清型，沙门菌的毒力基因spv一直是研究的热点，前期研究表明， spv表达的改变可以调节宿主细胞的自噬，但其影响自噬的确切机制尚未明确。.本项目利用前期腹泻儿童粪便中分离的鼠伤寒沙门氏菌为研究对象，通过自杀质粒构建spvB、spvC、spvBC基因缺陷鼠伤寒沙门菌并使用电转化技术构建spvBC基因回补株并进行鉴定，体内外实验观察spv表达与否与自噬的相关性并探讨PI3K-Akt-mTOR通路、p38 MAPK通路、AMPK通路在spv影响自噬中的作用及各通路间的相互作用。.基因缺陷变异株成功构建。经鉴定，spvB基因缺陷株缺失1749个碱基，spvC基因缺陷株缺失711个碱基， spvBC基因缺陷株缺失2773个碱基。高度稳定且含有绿色荧光蛋白标签的沙门氏菌表达载体及spv基因回补株构建成功，含有低拷贝质粒的回补株在连续培养10代或120h都未发生丢失。spv被抑制后自噬增强，沙门菌质粒毒力基因spvBC可通过诱导细胞自噬促进细菌在宿主细胞内的存活和增殖，进而加重细胞损伤。PI3K-Akt-mTOR通路可能在沙门菌质粒毒力基因spv诱导细胞自噬中发挥重要作用，但未观察到与其他信号通路间的明显协同作用及明显影响。沙门菌spv基因对肠粘膜上皮细胞Henle-407细胞自噬的抑制作用与p38 MAPK通路关系密切。p38 MAPK通路似乎是作为PI3K-Akt-mTOR通路的上游而非负反馈发挥作用，而对AMPK通路无明显影响。AMPK通路似乎能增强spv对自噬的影响，对PI3K-Akt-mTOR通路及p38 MAPK通路无明显作用。.本项目首次发现、证实，鼠伤寒沙门菌spvBC 缺陷后菌株对β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖甙类的代表药物敏感性均明显增强，这可能是通过影响外排泵AcrA 来完成的。本研究为沙门菌感染的临床治疗提供新的研究思路和靶点，为进一步探讨耐药及非耐药沙门菌株中spv对自噬影响的差异及其分子机制奠定基础。.本课题全面完成研究计划，发表学术论文1篇（标注资助），共培养硕士研究生4名。

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